[發(fā)明專利]睡蓮DNA指紋圖譜及其引物與構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910347887.4
• 申請日: 2019-04-28
• 公開（公告）號: CN110129472A
• 公開（公告）日: 2019-08-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蘇群;楊亞涵;田敏;盧家仕;毛立彥;唐毓瑋;卜朝陽;蔣慧萍
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京名華博信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11453
• 代理人: 李中強

1.獲取睡蓮DNA指紋圖譜的引物，其特征在于：引物采用UBC840、UBC841、UBC811、UBC834、UBC835、UBC843、UBC844、UBC845、UBC873、UBC880中的一種或多種。

2.睡蓮DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

1）睡蓮DNA提取；

2）ISSR-PCR 擴增反應及電泳檢測：采用ISSR引物對睡蓮DNA進行擴增，得到的ISSR-PCR 反應產(chǎn)物用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測；所述ISSR引物采用權(quán)利要求1所述的獲取睡蓮DNA指紋圖譜的引物；

3）DNA指紋圖譜構(gòu)建：根據(jù)每條引物呈現(xiàn)的條帶信息建立指紋圖譜：以睡蓮種質(zhì)資源編號為縱列，以每條譜帶的位點編號為橫行；其中該位點有擴增條帶表示為灰色，即該位點0-1 矩陣中為“1”，該位點沒有擴增條帶表示為無色，即該位點在 0-1 矩陣中為“0”，得到不同睡蓮品種的DNA指紋圖譜表。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的睡蓮DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于：睡蓮DNA提取采用完整的、無病蟲害、未展開的沉水幼葉；睡蓮DNA樣品濃度為50 ng/uL。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的睡蓮DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于：ISSR-PCR 擴增反應體系為：采用20ul的反應體系，包括2 ×Es Taq Master Mix（含染料）10 uL，睡蓮DNA及ISSR引物各1 uL，8 uL的ddH₂O補齊。

5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項所述的睡蓮DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于：ISSR-PCR 擴增程序為：(1) 94℃預變性1 min，(2) 94℃變性45s，(3)46-55℃退火45s，(4)72℃延伸 2 min，(5) 72℃延伸5 min；其中步驟(2)、(3)、(4)共35個循環(huán)，4℃保存。

6.根據(jù)權(quán)利要求5任一項所述的睡蓮DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于：ISSR-PCR擴增程序中，退火溫度根據(jù)所選用的ISSR引物來確定，具體如下：UBC840 53℃，UBC841 55℃，UBC811 55℃，UBC834 55℃，UBC835 52℃，UBC843 46℃，UBC844 53℃，UBC845 52℃，UBC873 46℃，UBC880 50。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲取睡蓮DNA指紋圖譜的引物在獲取睡蓮DNA指紋圖譜中的應用。

8.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項所述的睡蓮DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法所得到的睡蓮DNA指紋圖譜在對睡蓮種質(zhì)資源分類與鑒定中的應用。