[發(fā)明專利]一種呼吸道病毒的檢測方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910346624.1 | 申請日： | 2019-04-27 |
| 公開（公告）號： | CN110093455B | 公開（公告）日： | 2020-03-17 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 張婷;楊帆;金奇 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12R1/93 |
| 代理公司： | 北京華科聯(lián)合專利事務(wù)所(普通合伙) 11130 | 代理人： | 王為;孟旭 |
| 地址： | 100176 北京市*** | 國省代碼： | 北京;11 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 呼吸道 病毒 檢測 方法 | ||
1.一種呼吸道病毒的檢測方法，該方法用于非診斷目的，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
(1)呼吸道樣本病毒富集和核酸提取：基于呼吸道待檢測樣本富集、提取病毒核酸；
(2)高通量測序文庫構(gòu)建和驗(yàn)證：用酶切方法構(gòu)建可用于高通量測序的核酸庫；
(3)高通量測序：設(shè)定輔助基于宏基因組學(xué)技術(shù)的病毒感染檢測的內(nèi)參、對照；
(4)生物信息學(xué)分析：從高通量測序數(shù)據(jù)中準(zhǔn)確分析樣本中的物種組成；
其中，(1)呼吸道樣本病毒富集和核酸提取：
a.樣本取樣：首先從住院病人分別診斷為慢阻肺病人和過敏病人，肺出血病人及肺癌病人取咽試子快速保存在3ml病毒采集管中，震蕩30s，
b.樣本細(xì)胞裂解和離心：取步驟a樣本各400μl，15000rpm，4℃，離心10min，取上清到另一1.5ml的EP管中，沉淀中加500μl無RNA酶的純水，15000rpm，4℃，離心10min，取上清與第一次上清合并，
c.樣本濃縮：取上清800-850μl，用0.22μm濾膜過濾至潔凈EP管中，再加入到2ml超濾管中，4000g，4℃，離心10min，離心濃縮樣品40-50μl，
d.樣本宿主游離核酸去除：上述40-50μl濃縮樣品管中加入DNA clean XP和RNA cleanXP磁珠各50μl，冰上5min，用磁力架吸棄磁珠，取上清114μl，
e.樣本宿主細(xì)胞核酸去除：用酶消化的方法去除宿主細(xì)胞核酸
然后在37℃，消化30min，
f.提取病毒核酸RNA：用QIAGEN公司的QIamp viral RNA miniKit提取RNA病毒的核酸包括RNA，用30μl AVE洗脫樣品中的病毒RNA，操作方法如下：
1)取560μL Buffer AVL-carrier RNA加入到140μL/管的樣液中，渦旋15s，
2)室溫靜置10min，瞬時(shí)離心，便于蓋上液體回流到管底，
3)加入560μL無水乙醇，渦旋15s，瞬時(shí)離心，
4)取630μL樣液加入column中，離心1min，8000rpm，將- column放入潔凈2ml收集管中，棄去含濾液舊收集管，
5)再取余下630μL樣液加入column中，離心1min，8000rpm，將- column放入潔凈2ml收集管中，棄去含濾液舊收集管，
6)加入AW1，500μL/管，離心1min，8000rpm，將- column放入潔凈2ml收集管中，棄去含濾液舊收集管，
7)加入AW2，500μL/管，離心3min，13000rpm，
8)空離1min，13000rpm，
9)將- column放入潔凈1.5ml EP管中，加入AVE 30μL/管，離心1min，8000rpm，于-80℃低溫保存樣品，
g.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：將上步提取出來的病毒RNA轉(zhuǎn)化成更穩(wěn)定更易保存的cDNA，用superscriptTM IV First-strand synthesis system合成cDNA，方法如下：
1)先合成一鏈：
2)混合并短暫離心，
3)RNA-引物混合物在65℃加熱5分鐘，然后在冰上孵育至少1分鐘，
4)渦旋并短暫離心5×SSIV緩沖液，
5)將以下組分混合在上述反應(yīng)管中，共計(jì)20μL
6)蓋上管子，混合，然后短暫離心內(nèi)容物，
7)反應(yīng)混合物在23℃下孵育10分鐘，50-55℃孵育10分鐘，80℃下孵育10分鐘使反應(yīng)失活，4℃冷卻1分鐘，
8)采用Klenow完成上述cDNA第二鏈的合成，
95℃，2min，4℃2分鐘，在上述體系加入1μl 3’-5’exo-Klenow DNA聚合酶，混勻，執(zhí)行下列程序：37℃，60s；75℃，10min，
h.非序列依賴性擴(kuò)增：
PCR反應(yīng)體系：用Takala的green MIX，
將上述PCR反應(yīng)體系放入PCR儀，執(zhí)行下列PCR反應(yīng)程序：
*依據(jù)核酸的量，決定循環(huán)次數(shù)，第g步獲得的cDNA- 用非序列依賴性引物進(jìn)行少許擴(kuò)增，直到滿足下一步高通量測序樣本建庫所要求的上樣量200pg，
I.病毒核酸純化：純化第g步或第h步獲得的病毒核酸用于后續(xù)的測序前的文庫構(gòu)建和驗(yàn)證準(zhǔn)備，使用QIAGEN-PCR回收試劑盒，按說明進(jìn)行。
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