[發(fā)明專利]一種檢測氯霉素的均相比色生物分析方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910345502.0
• 申請日: 2019-04-26
• 公開（公告）號: CN109946293B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賴國松;郭鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北師范大學(xué)
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/33
• 代理公司: 黃石市三益專利商標(biāo)事務(wù)所 42109
• 代理人: 林曉珍

1.一種檢測氯霉素的均相比色生物分析方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）制備核酸限域體復(fù)合物

依次將濃度為2μM的Y₁₁、Y₁₂和Y₁₃單鏈DNA各10μL與10μL的氯霉素適配體加入至PV管中，再置于95℃水浴中加熱5min，自然冷卻2h至室溫，從而形成Y1-aptamer具有限域效應(yīng)的核酸復(fù)合物；

與此同時，依次將濃度為2μM Y₂₁、Y₂₂和Y₂₃單鏈DNA各10μL加入至另一PV管中，再置于95℃水浴中加熱5min，自然冷卻2h至室溫，從而形成Y2具有限域效應(yīng)的核酸復(fù)合物；

再將上述兩個PV管中的溶液混合，在37℃條件下充分混勻反應(yīng)1h，從而形成Y1-aptamer-Y2核酸限域體復(fù)合物；

上述Y₁₁、Y₁₂、Y₁₃、Y₂₁、Y₂₂、Y₂₃單鏈DNA和氯霉素適配體的堿基系列為：

Y₁₁: 5’-GGA GCA GAC AAC GCC ACT CAT GTA GCA CCT ACC ACC GGG TAG GGC GGGTTG GG-3’；

Y₁₂: 5’-GTA GAT CAG AGT GTG CGT TGT CTG CTC CCT ACC ACC GGG TAG GGC GGGTTG GG-3’；

Y₁₃: 5’-GTG CTA CAT GAG TGA CAC TCT GAT CTA CCT ACC ACC GGG TAG GGC GGGTTG GG -3’；

Y₂₁: 5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGA CAA CTC ACT GAA GTT TCA TCG ACA GAT CCAGTC GCT GTC ATG-3’；

Y₂₂: 5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGA CAA CTC ACT GAA GTC ATG ACA GCG ACT GTACAG AAT CAT CTT-3’；

Y₂₃: 5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGA CAA CTC ACT GAA GTA AGA TGA TTC TGT AGATCT GTC GAT GAA-3’；

氯霉素適配體：5’-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA G -3’；

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液中氯霉素含量的檢測

取6份體積均為70μL的核酸限域體復(fù)合物溶液分別置于6支PV管中，分別向其中加入10μL濃度梯度為20nM、50nM、100nM、200nM、500nM和1000nM的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，將反應(yīng)液置于恒溫混勻儀中在37℃下溫育反應(yīng)1h，接著向每支PV管中加入90μL pH=7.4的HEPES緩沖溶液進(jìn)行稀釋，再向其中加入10μL濃度為3μM的hemin溶液，所述hemin溶液是由濃度為1mM的Hemin原液經(jīng)過pH=7.4的HEPES緩沖溶液稀釋而成，將PV管置于25℃下繼續(xù)混勻反應(yīng)1h；再向其中加入10μL濃度為10mM的H₂O₂溶液和10μL濃度為10mM的ABTS溶液，催化顯色反應(yīng)4min后，利用紫外-可見分光光度計在390nm~480nm波長范圍內(nèi)記錄檢測標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收光譜，并根據(jù)420nm波長處的吸光度大小來進(jìn)行工作曲線的構(gòu)建和標(biāo)準(zhǔn)溶液中CAP的定量分析；

（3）樣品中氯霉素含量的檢測

將樣品進(jìn)行前處理后，取處理后的樣品溶液10μL置于PV管中，向其中加入70μL核酸限域體復(fù)合物溶液，將混合液置于恒溫混勻儀中在37℃下溫育反應(yīng)1h，再向PV管中加入90μLpH=7.4的HEPES緩沖溶液進(jìn)行稀釋，然后再向其中加入10μL濃度為3μM的hemin溶液，所述hemin溶液是由濃度為1mM的hemin原液經(jīng)過pH=7.4的HEPES緩沖溶液稀釋而成，將PV管置于25℃下繼續(xù)混勻反應(yīng)1 h；再向其中加入10μL濃度為10mM的H₂O₂溶液和10μL濃度為10mM的ABTS溶液，催化顯色反應(yīng)4min后，利用紫外-可見分光光度計在390nm-480nm波長范圍內(nèi)記錄檢測溶液的吸收光譜，并根據(jù)其420nm波長處的吸光度大小和工作曲線來計算樣品溶液中的CAP含量。

2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測氯霉素的均相比色生物分析方法在檢測樣品中氯霉素含量中的應(yīng)用。