[發(fā)明專利]構(gòu)建強(qiáng)力霉素/米非司酮誘導(dǎo)過表達(dá)的帶有熒光蛋白標(biāo)記基因的雙誘導(dǎo)表達(dá)載體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910344079.2
• 申請(qǐng)日: 2019-04-26
• 公開（公告）號(hào): CN110551753B
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳波;馬峰;滕嘉雯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/65
• 代理公司: 成都九鼎天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51214
• 代理人: 易小藝

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種構(gòu)建Doxycycline/Mifepristone誘導(dǎo)過表達(dá)的帶有熒光蛋白標(biāo)記基因的雙誘導(dǎo)表達(dá)載體及構(gòu)建方法及應(yīng)用，所述表達(dá)載體系統(tǒng)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明中表達(dá)載體系統(tǒng)可以在幾乎所有生物和細(xì)胞中正常表達(dá)且無滲漏表達(dá)，避免了基因沉默以及轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒可能帶來的細(xì)胞毒性和免疫反應(yīng)，系統(tǒng)特異性高，安全性高，誘導(dǎo)效率高，誘導(dǎo)具有可逆性，可以用多種轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種構(gòu)建強(qiáng)力霉素/米非司酮(Doxycycline/Mifepristone)誘導(dǎo)過表達(dá)的帶有熒光蛋白標(biāo)記基因的雙誘導(dǎo)表達(dá)載體及構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前已知的基因過表達(dá)載體有慢病毒載體、類腺病毒載體、轉(zhuǎn)座子載體、非整合質(zhì)粒等等，其中整合載體是最適合構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或模式動(dòng)物的基因過表達(dá)載體，慢病毒載體和轉(zhuǎn)座子載體PiggyBac是目前公認(rèn)最有效的整合載體。

慢病毒載體在高滴度條件下幾乎可以轉(zhuǎn)染全部目標(biāo)細(xì)胞，侵染及整合效率高。但它也有一些缺點(diǎn)：存在物種特異性，一般而言只能轉(zhuǎn)染人類細(xì)胞，應(yīng)用面有限；載體本身體積大而有效容量小，分子遺傳學(xué)操作困難；部分基因序列包裝困難；慢病毒載體整合到基因組后可能只在少數(shù)細(xì)胞群中有表達(dá)，很容易被沉默，基因表達(dá)水平不高。

慢病毒載體中的pTRIPZ載體系統(tǒng)(Invitrogen公司)，其Tet-on過表達(dá)系統(tǒng)表現(xiàn)優(yōu)異：目標(biāo)基因的啟動(dòng)子是CMV，反式激活因子的啟動(dòng)子是pUbC，二者沒有物種及細(xì)胞型的表達(dá)特異性，應(yīng)用面廣。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種構(gòu)建強(qiáng)力霉素/米非司酮(Doxycycline/Mifepristone)誘導(dǎo)過表達(dá)的帶有熒光蛋白標(biāo)記基因的雙誘導(dǎo)表達(dá)載體及構(gòu)建方法及應(yīng)用，表達(dá)載體系統(tǒng)可以在幾乎所有生物和細(xì)胞中正常表達(dá)且無滲漏表達(dá)，避免了基因沉默以及轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒可能帶來的細(xì)胞毒性和免疫反應(yīng)，系統(tǒng)特異性高，安全性高，誘導(dǎo)效率高，誘導(dǎo)具有可逆性，可以用多種轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作。

解決以上技術(shù)問題的本發(fā)明中的一種構(gòu)建強(qiáng)力霉素/米非司酮 (Doxycycline/Mifepristone)誘導(dǎo)過表達(dá)的帶有熒光蛋白標(biāo)記基因的雙誘導(dǎo)表達(dá)載體，其特征在于：所述表達(dá)載體系統(tǒng)核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明中一種構(gòu)建Doxycycline/Mifepristone誘導(dǎo)過表達(dá)的帶有熒光蛋白標(biāo)記基因的雙誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)以pSwitch為模板構(gòu)建反式元件載體PB-Gal4-Teton-trans-vector；

(2)以GeneV5-His B為模板構(gòu)建順式表達(dá)載體PB-Gal4-Teton-cis-vector；

(3)將以上步驟(1)和步驟(2)元件和其它輔助載體(PB200PA-1)載體組合在一起構(gòu)建成一套雙誘導(dǎo)過表達(dá)載體系統(tǒng)。

本發(fā)明中根據(jù)已有的基于PiggyBac的PB-tet-on-OE(Tet-on系統(tǒng))和pSwitch和GeneV5-His B載體系統(tǒng)(Gal4/RU486系統(tǒng))(均是Invitrogen載體或其衍生載體)，通過分子克隆構(gòu)建嶄新的雙誘導(dǎo)過表達(dá)系統(tǒng)。由于元件過大過多，將分別構(gòu)建反式元件載體和順式元件載體，分別包含Tet-on系統(tǒng)和Gal4/RU486系統(tǒng)的全部反式元件和順式元件。

本發(fā)明中構(gòu)建Doxycycline/Mifepristone誘導(dǎo)過表達(dá)的帶有熒光蛋白標(biāo)記基因的雙誘導(dǎo)表達(dá)載體的方法，具體包括如下步驟：

步驟一：反式元件載體PB-Gal4-Teton-trans-vector的構(gòu)建：