[發明專利]一種ω-轉氨酶雙突變體及其應用

有效

• 申請號: 201910343331.8
• 申請日: 2019-04-26
• 公開（公告）號: CN110144335B
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 黃俊;梅樂和;呂常江;朱婉麗;王宏鵬;胡升;趙偉睿
• 申請（專利權）人: 浙江科技學院
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12P7/26
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

本發明公開了一種ω?轉氨酶雙突變體及其應用，該ω?轉氨酶雙突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明ω?轉氨酶雙突變體由野生型的土曲霉(Aspergillus terreus)ω?轉氨酶第115位的苯丙氨酸突變成亮氨酸，第118位的亮氨酸突變成蘇氨酸而獲得；該ω?轉氨酶雙突變體的半失活溫度比野生型提高了8.8℃，熱解折疊溫度比野生型提高了7.7℃，在40℃時的半衰期較野生型延長了59.0min，是野生型的9.55倍。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種ω-轉氨酶雙突變體及其應用。

背景技術

胺轉氨酶(ATAs)以其高立體選擇性和環境溫和的反應條件，成為制備光學純手性胺最主要的生物催化劑。一般來說，提高溫度可以增加原料與產物的溶解度降低其粘度，加快反應速度，但天然狀態下的酶的溫度耐受性差，高溫易使酶失活變性，如何提高酶的熱穩定性是蛋白質工程極具挑戰性的研究。

由Michael Smith發明興起的定點突變技術，是在已知的基因序列中插入、取代和缺失特定核苷酸，從而改變蛋白質一級結構。張曉鳳等(張曉鳳.定點突變提高土曲霉Aspergillus terreus脂肪酶的催化活性[J].生物工程學報,2018,34(7):1091-1105)對酸性脂肪酶底物結合口袋附近和Lid區域的位點進行突變，獲得了催化活性顯著提高的ATLV218W和ATL Lid突變體。

定點飽和突變技術提升了點突變的可能性，能將某個預測功能位點同時替換成其它19種氨基酸。通過設計簡并引物構建飽和突變文庫因突變子數量龐大需要簡單靈敏的高通量篩選方法以獲得有效突變體。例如：林玲等(林玲.利用定向進化及半理性設計提高谷氨酸脫羧酶催化活性的研究[D].浙江:浙江大學,2013)對GAD1407谷氨酸脫羧酶的第51位點構建飽和突變文庫，并采用郁凱等(Yu K,Hu S,Huang J,Mei L H.A high-throughputcolorimetric assay tomeasure the activity of glutamate decarboxylase[J].Enzyme Microb.Technol,2012,49(3):272-276)根據溴甲酚紫指示劑能反映谷氨酸脫羧酶催化底物脫羧引起體系pH值變化，而建立了通過觀察顏色的深淺來判斷谷氨酸脫羧酶活性高低的高通量篩選方法，最終篩選獲得突變體Q51H，其催化活性是野生型的2.2倍。

申請公布號為CN109486778A的發明專利申請公開了一種基于共進化網絡的ω-轉氨酶突變體以及制備方法和應用，該ω-轉氨酶突變體的第118位氨基酸由亮氨酸突變為丙氨酸或蘇氨酸，與野生型相比，ω-轉氨酶突變體的半失活溫度提高3.7℃和5.3℃，半衰期延長13.7min和19.1min。

然而，單突變位點的突變對酶活穩定性的改善是有限的，為了進一步的提高轉氨酶的熱穩定性，需要在其他位點引入突變。

發明內容

本發明提供了一種ω-轉氨酶雙突變體，在利用蛋白質共進化網絡預測高交聯殘基位點的基礎上，結合迭代飽和突變技術，構建迭代飽和突變文庫，篩選獲得雙突變體L118T-F115L，該雙突變體的T_m和T₅₀¹⁰相比于野生型分別提高了7.7℃和8.8℃，其40℃時的t_1/2較野生型延長了59.0min。

具體技術方案如下：

本發明提供了一種ω-轉氨酶雙突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述雙突變體是由野生型的土曲霉(Aspergillus terreus)ω-轉氨酶第115位的苯丙氨酸(密碼子TTT)突變成亮氨酸(密碼子CTA)，第118位的亮氨酸(密碼子TTG)突變成蘇氨酸(密碼子ACG)而獲得的，稱為L118T-F115L雙突變體。