[發明專利]全細胞催化生產5-氨基戊酸的工程菌及5-氨基戊酸的制備方法

在審

• 申請號: 201910342666.8
• 申請日: 2019-04-26
• 公開（公告）號: CN111849845A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 溫廷益;米杰;張蕓;劉樹文
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京律和信知識產權代理事務所(普通合伙) 11446
• 代理人: 武玉琴;張羽

本發明涉及一種全細胞催化生產5?氨基戊酸的工程菌及5?氨基戊酸的制備方法。該工程菌與出發菌相比，具有γ?氨基丁醛脫氫酶abD基因、賴氨酸脫氫酶cadA基因和丁二胺氧化酶puO基因的表達。本發明通過γ?氨基丁醛脫氫酶abD，賴氨酸脫氫酶cadA，丁二胺氧化酶puO表達組合優化和最適宿主菌的選擇，構建高催化速率和高催化濃度的5?氨基戊酸全細胞催化工程菌。

技術領域

本發明總地涉及生物技術領域，具體涉及全細胞催化生產5-氨基戊酸的工程 菌及5-氨基戊酸的制備方法。

背景技術

5-氨基戊酸(5-aminovalerate,5AVA)是一種奇數碳的功能單體原料，可通過 分子內脫水環化生產δ-戊內酰胺(2-piperidone)，進一步加工成為生物基尼龍-5 和尼龍-65。

聚酰胺(Polyamide,PA)俗稱尼龍(Nylon)，包括由同一種分子形成的單聚 物及由二元胺或二元酸為單體形成的共聚物等不同形式，在紡織、汽車、電子電 器、生物塑料和醫藥等行業有廣泛的應用。世界上主要通過石化原料生產聚酰胺， 全球每年需要消耗約700萬噸的聚酰胺產品，且呈現逐年增長的趨勢，造成能源 資源短缺、生態環境惡化等問題。目前，廣泛使用的聚酰胺PA6和PA66產品是 由己二酸和己二胺聚合而成，其中己二酸可以通過微生物法合成，而己二胺依賴 于傳統的石油化工合成。研究發現以五碳平臺化合物(5-氨基戊酸、5-氨基戊酸和 戊二酸等)為主要原料生產的新型尼龍PA5X系列產品，具有良好的流動性、較 高的力學和熱學性能以及本質阻燃性，可以替代PA66。因此，利用可再生的物質資源，開展其它的五碳平臺化合物的生物合成研究，對于開發新型的生物基聚 酰胺、聚氨酯等高分子聚合物具有重要的經濟學和生態學意義。

目前工業上制備5-氨基戊酸主要使用化學法合成，一般采用戊內酰胺或戊內 酰胺聚合物(尼龍6的熔塊、廢絲、廢棄織物、漁網等)水解后精制而得，其反 應條件苛刻，能耗大，設備腐蝕大，效率低，分離復雜。為取代化學合成法，研 究人員積極探索開發條件溫和，轉化高效的5-氨基戊酸的生物合成路線。生物法 合成目前主要有發酵法和催化法兩種。

發酵法生產5-氨基戊酸主要通過在大腸桿菌或者谷氨酸棒桿菌中構建5-氨基 戊酸合成途徑實現從葡萄糖合成5-氨基戊酸。Park等人在大腸桿菌中人工構建了 由davB-davA催化的5-氨基戊酸合成途徑，利用代謝工程改造胞內代謝途徑，解 除天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸的反饋抑制作用，敲除cadA基因阻斷賴氨酸到 5-氨基戊酸的轉化，能夠合成0.86g/L5-氨基戊酸，首次建立了從葡萄糖轉化為5- 氨基戊酸的合成路線。通過進一步優化代謝網絡和培養條件，構建的大腸桿菌工 程菌通過添加20g/L葡萄糖發酵能夠產生3.6g/L5-氨基戊酸。Shin等人通過對來 源于惡臭假單胞菌的davB和davA基因的密碼子進行優化，利用具有不同轉錄強 度的啟動子共表達的方式，在谷氨酸棒桿菌中實現了搖瓶發酵產6.9g/L 5-氨基戊 酸。進一步阻斷5-氨基戊酸轉化為戊二酸，5L發酵罐的5-氨基戊酸產量提高到 33g/L。Jorge等人通過在谷氨酸棒狀桿菌中引入大腸桿菌的賴氨酸脫氫酶(LdcC), 戊二胺轉氨酶(PatA),γ-氨基丁醛脫氫酶(PatD)，將對應的基因ldcC,patA,patD整合至谷氨酸棒狀桿菌的染色體上，通過發酵法生產5-氨基戊酸，最終產量達到5.1g/L。

與發酵法相比，全細胞催化的5-氨基戊酸生物合成是利用賴氨酸作為底物， 直接轉化生產5-氨基戊酸。這樣的生物合成路線更具有競爭力和經濟性。全細胞 催化法目前在大腸桿菌中通過異源表達來源于惡臭假單胞菌KT2440的davB基因 編碼的賴氨酸2-單加氧酶和davA基因編碼δ-戊酰胺酶，全細胞催化12小時可以 將30g/L賴氨酸催化轉化為20.8g/L的5-氨基戊酸。通過高密度發酵培養，可以 將60g/L賴氨酸催化轉化生成47.96g/L的5-氨基戊酸。目前，5-氨基戊酸生物催 化的現有技術存在工程菌細胞催化性能低，產量水平與實現工業化應用存在較大 差距。挖掘不同催化性能的酶，利用大腸桿菌作為宿主細胞，組建不同的催化途 徑，構建新的全細胞催化工程菌催化生產5-氨基戊酸，有助于5-氨基戊酸生物催 化的工業化生產。