[發明專利]一種電子煙氣溶膠的直接暴露體外毒性測試方法

在審

• 申請號: 201910342200.8
• 申請日: 2019-04-26
• 公開（公告）號: CN109988809A
• 公開（公告）日: 2019-07-09
• 發明（設計）人: 李翔;華辰鳳;尚平平;謝復煒;喬梁峻;劉惠民;謝劍平
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

1.一種電子煙氣溶膠的直接暴露體外毒性測試方法，其特征在于：該方法可以進行多種細胞毒性終點測試，以及多種炎癥因子釋放水平的檢測，更加全面反映電子煙氣溶膠的體外毒性效應，包括以下步驟：

電子煙氣溶膠發生；

細胞直接暴露；

細胞毒性測試；

炎癥因子檢測。

2.根據權利要求1所述的電子煙氣溶膠的直接暴露體外毒性測試方法，其特征在于：步驟（1）中電子煙氣溶膠發生的具體方式如下：

吸煙機抽吸電子煙，包括抽吸曲線、每口抽吸持續時間、每口抽吸容量、每口抽吸間隔時間的抽吸參數可根據實驗目的進行設置；電子煙連續抽吸適量口數，以電子煙抽吸口數作為后續體外毒性測試的暴露劑量。

3.根據權利要求2所述的電子煙氣溶膠的直接暴露體外毒性測試方法，其特征在于：為保證毒性指標測試結果的穩定性，一般情況下，抽吸口數在10~200口之間。

4.根據權利要求1所述的電子煙氣溶膠的直接暴露體外毒性測試方法，其特征在于：步驟（2）中細胞直接暴露的具體方式如下：

電子煙液經霧化后新鮮產生的電子煙氣溶膠在真空負壓下導入至煙氣暴露艙內，煙氣暴露倉具有煙氣進氣口和廢氣排出口，可保證暴露倉內的大氣壓平衡；

暴露艙內放置有培養的細胞，細胞生長在半透膜上，半透膜的孔徑為0.4 μm，可保證細胞培養液穿過半透膜為細胞提供營養，半透膜下方為細胞培養液，上方為電子煙氣溶膠環境，細胞與進入暴露艙內的電子煙氣溶膠直接接觸暴露；

實驗中設置合成空氣暴露組作為對照組，對應于每一組電子煙抽吸口數即一個電子煙氣溶膠暴露劑量，分別設置相應暴露時長的合成空氣暴露組。

5.根據權利要求1所述的電子煙氣溶膠的直接暴露體外毒性測試方法，其特征在于：步驟（3）中細胞毒性測試的具體方式如下：

經電子煙氣溶膠暴露后的細胞以及成空氣暴露組細胞更換新鮮細胞培養基后恢復培養24 h，隨后將細胞培養基吸出凍存在-80℃用于后續的炎癥因子檢測實驗；

細胞經預熱的磷酸緩沖鹽溶液洗一次，加入中性紅染液，于37℃、5% CO₂條件下培養3h，吸去中性紅染液，加入磷酸緩沖鹽溶液洗一次，加入中性紅提取液，室溫下快速振蕩20~40 min，將中性紅提取液轉入96孔板中，每孔150 μl/孔；

使用酶標儀檢測96孔板上中性紅提取液在540 nm波長處的吸光值，用于檢測細胞受損或存活情況。

6.根據權利要求1所述的電子煙氣溶膠的直接暴露體外毒性測試方法，其特征在于：步驟（4）中炎癥因子檢測的具體方式如下：

炎癥因子的檢測目標為白細胞介素6（IL-6）和白細胞介素8（IL-8）；

將收集凍存的細胞培養液于室溫下進行復融，經離心后收集上清液，樣品上清液加入到經抗IL-6或IL-8的小鼠單克隆抗體包被的96孔板中，貼上封板膜室溫孵育2 h；

吸去96孔板孔中的液體，磷酸緩沖鹽溶液洗滌2~4次

加入經辣根過氧化物酶標記的二抗，即抗IL-6的多克隆抗體，或抗IL-8的單克隆抗體，室溫孵育1~2 h；

磷酸緩沖鹽溶液洗滌2~4次，加入辣根過氧化物酶底物溶液，室溫避光孵育30~40 min，加入終止液；

于30 min內使用酶標儀檢測在450 nm波長處的吸光值，校正波長540 nm；

以檢測所釋放的炎癥因子的濃度來判斷電子煙氣溶膠的致細胞炎癥損傷效應。

7.根據權利要求1或3或4或5或6所述的電子煙氣溶膠的直接暴露體外毒性測試方法，其特征在于：所述細胞為人支氣管上皮細胞BEAS-2B、人肺腺癌細胞A549。

8.根據權利要求4所述的電子煙氣溶膠的直接暴露體外毒性測試方法，其特征在于：所述半透膜為聚碳酸酯膜，膜上微孔直徑為0.4 μm。