[發(fā)明專利]一種利用過(guò)表達(dá)氮代謝調(diào)控蛋白基因的工程菌制備生物絮凝劑的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910341891.X
• 申請(qǐng)日: 2019-04-25
• 公開（公告）號(hào): CN110129377A
• 公開（公告）日: 2019-08-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何寧;王玲偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P1/04
• 分類號(hào): C12P1/04;C12N15/31;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/10
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;姜謐

1.一種利用過(guò)表達(dá)氮代謝調(diào)控蛋白基因的工程菌制備生物絮凝劑的方法，其特征在于：該工程菌為過(guò)表達(dá)氮代謝調(diào)控蛋白NrgB基因的地衣芽孢桿菌，其中含有負(fù)載了如SEQID NO：01所示的氮代謝調(diào)控蛋白NrgB基因的表達(dá)載體PHY300PLK-PamyL-TTamyL，該地衣芽孢桿菌已于2009年1月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No.2876。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)通過(guò)如SEQ ID NO：02所示的正向引物和如SEQ ID NO：03所示的反向引物PCR擴(kuò)增所述氮代謝調(diào)控蛋白NrgB基因，將其插入到表達(dá)載體PHY300PLK-PamyL-TtamyL的組成型啟動(dòng)子PamyL下游的多克隆位點(diǎn)，獲得PHY300-nrgB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；

(2)將足夠的上述PHY300-nrgB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入所述地衣芽孢桿菌中，獲得所述工程菌；

(3)將上述工程菌的單菌落接種于液體種子培養(yǎng)基中，35-37℃并200rpm的條件下培養(yǎng)12-16h，獲得種子培養(yǎng)液；

(4)將上述種子培養(yǎng)基以3-5％的體積比接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30-40℃并150-300rpm條件下培養(yǎng)50-60h，獲得發(fā)酵液；

(5)將上述發(fā)酵液進(jìn)行離心，獲得上清液；

(6)將上述上清液通過(guò)乙醇沉淀后，離心獲得沉淀；

(7)將上述沉淀溶解于超純水中，進(jìn)行真空冷凍干燥，即得所述生物絮凝劑。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述種子培養(yǎng)基由以下配比的原料組成，單位為g/L：葡萄糖7-12，酵母膏0.3-0.6，尿素0.3-0.6，KH₂PO₄ 0.1-0.3，K₂HPO₄ 0.1-0.3，NaCl 0.1-0.3，MgSO₄·7H₂O 0.2-0.5，蒸餾水，pH 7.2-8.0。

4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)基由以下配比原料組成，單位為g/L：葡萄糖13-16，酵母膏0.5-1，尿素1-3，KH₂PO₄ 4-6，K₂HPO₄ 1-3，NaCl 1-3，MgSO₄·7H₂O 0.01-0.1，蒸餾水，pH 7.2-8.0。

5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟(6)中，乙醇沉淀具體為：在所述上清液中加入3-5倍體積的無(wú)水乙醇，于3-5℃靜置10-13h。

6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟(6)中，離心的速度為5000-7000rpm，離心的時(shí)間為12-16min，離心的溫度為3-5℃。