[發(fā)明專利]可防控石斑魚神經(jīng)壞死病的轉(zhuǎn)基因微藻、飼料及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910336218.7
• 申請日: 2019-04-24
• 公開（公告）號(hào): CN110117544A
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧曉東;費(fèi)小雯
• 申請（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/13
• 分類號(hào): C12N1/13;C07K14/08;C12N15/40;C12N15/79;A23K50/80;A23K10/16;C12R1/89
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 張新蕊

本發(fā)明提供了一種含有SEQ ID NO.1所示序列或與該基因具有90％以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列的外殼蛋白基因的表達(dá)載體，該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后得到的轉(zhuǎn)基因微藻，以及含有該轉(zhuǎn)基因微藻的飼料。本發(fā)明采用含有本發(fā)明外殼蛋白基因的表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化石斑魚幼魚可食用的微藻后，喂食石斑魚幼魚，使石斑魚持續(xù)獲得抗原的刺激免疫，達(dá)到對魚類病毒性神經(jīng)壞死病的預(yù)防和治療，能有效防控石斑魚神經(jīng)壞死病，具有環(huán)境友好的特色和較高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值，例如具體實(shí)施方式中將含有本發(fā)明外殼蛋白基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化衣藻，獲得工程藻株，喂養(yǎng)石斑魚幼魚，能夠有效降低石斑魚神經(jīng)壞死病病死率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種可防控石斑魚神經(jīng)壞死病的轉(zhuǎn)基因微藻、飼料及應(yīng)用。

背景技術(shù)

魚類病毒性神經(jīng)壞死病(viral nervous necrosis，VNN)是養(yǎng)殖魚類常見的疾病之一，主要感染40余種海洋魚類的幼魚和稚魚，給水產(chǎn)苗種養(yǎng)殖企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Lin C al.,2007Mu Y al.,2013)，患病魚臨床癥狀為食欲降低、行為異常、轉(zhuǎn)圈、魚體發(fā)黑、或腹部朝上漂浮于水面，難于下沉，病魚腹部腫大(Costa JZ al.，2016)，累積死亡率可達(dá)到65-100％。珍珠龍膽石斑魚，是棕點(diǎn)石斑魚(俗稱老虎斑，母本)與鞍帶石斑魚(俗稱龍膽斑，父本)雜交培育的新品種，除食用之外，還可以用作觀賞魚養(yǎng)殖，市場前景廣闊。由于受神經(jīng)壞死病毒(nervous necrosis virus，NNV)感染，使珍珠龍膽石斑魚育苗生產(chǎn)造成極大損失。目前對于此病毒病還沒有特效藥物。VNN的病原是病毒性神經(jīng)壞死病毒(nervousnecrosis virus，NNV)，在分類上屬于羅達(dá)病毒科(Nodaviridae)，野田村病毒屬，由2個(gè)分子的單股正鏈RNA1和RNA2組成病毒基因組，分別編碼復(fù)制酶和外殼蛋白(CP)(Munday B Let al.,2002)。

目前對于此病毒病還沒有特效藥物，治療方式有魚用疫苗或口服免疫等。魚用疫苗包括傳統(tǒng)的滅活疫苗、減毒疫苗、多價(jià)疫苗，以及新型疫苗，如合成肽疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗。新型疫苗基本都是通過基因工程的方法將抗原基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，獲得抗原蛋白(合成肽疫苗、亞單位疫苗)，或直接將抗原基因轉(zhuǎn)入魚基因組中(DNA疫苗)，獲得持續(xù)的保護(hù)作用。疫苗接種方法有三種方式：即注射、浸泡、口服。由于幼魚和稚魚體質(zhì)羸弱，發(fā)育不全，通過傳統(tǒng)的注射魚身獲得免疫的方法將造成魚苗極大的傷害，從而造成很高的死亡率。口服免疫是近年發(fā)展起來的一種新型的接種方式，有關(guān)魚類口服免疫機(jī)制，一般認(rèn)為魚類口服疫苗在腸道蠕動(dòng)作用下，小分子抗原可經(jīng)腸粘膜細(xì)胞間隙滲透進(jìn)入血液；大分子抗原則由腸粘膜附著的巨嗜細(xì)胞吞噬后，提呈到達(dá)相關(guān)的淋巴組織，也可經(jīng)細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)，運(yùn)輸?shù)窖h(huán)系統(tǒng)，經(jīng)血液或淋巴液轉(zhuǎn)運(yùn)至淋巴結(jié)產(chǎn)生免疫反應(yīng)(Schep et al.,1999)。該機(jī)制已在鯉魚(Cyprinus carpio)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、金魚(Carassius auratus)等多種魚類中得到證實(shí)(Rombout et al.，1985；Ezeasor et al.,1980；Temkin et al.,1986)。羅曉春等(2005)對斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)相關(guān)免疫組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明眼角膜、鰓、前腸及后腸等粘膜組織中存在杯狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞，具有完成免疫應(yīng)答的細(xì)胞基礎(chǔ)。口服疫苗的優(yōu)點(diǎn)是操作方便，對魚體無損傷；缺點(diǎn)是免疫效果比注射法低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，構(gòu)建含本發(fā)明外殼蛋白基因的表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化微藻，得到的轉(zhuǎn)基因微藻，可用于石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病的生物防控，具有環(huán)境友好的特色和較高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種防治石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病的飼料，其含有轉(zhuǎn)基因微藻，所述轉(zhuǎn)基因微藻由含有外殼蛋白基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化石斑魚幼魚可食用的微藻制成，其中，所述外殼蛋白基因?yàn)橄铝泻塑账嵝蛄兄唬?/p>

1)石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病毒外殼蛋白(NNVCP)基因，序列表中SEQ ID NO.1所示序列；