[發(fā)明專利]一種氨基酸緩沖液及血漿游離DNA提取試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910334438.6
• 申請日: 2019-04-24
• 公開（公告）號: CN110129314B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊芳梅;張惠賢;盧德景;徐紅梅
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥歐創(chuàng)基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 杭州裕陽聯(lián)合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 金方瑋

本發(fā)明公開了一種氨基酸緩沖液及血漿游離DNA提取試劑盒，試劑盒包括如下試劑：裂解液，蛋白酶K工作液，氨基酸吸附緩沖液，洗滌液，TE洗脫液；氨基酸吸附緩沖液包括：80?200mM氨基酸，0.1?0.3M離液鹽，5％?15％PEG，0.5?1.2M氯化鈉，40?100mM Tris?HCl，20?50mM EDTA，pH 2.1?2.4；本發(fā)明通過將氨基酸與低濃度的離液鹽結(jié)合，控制緩沖液的pH值，提高提取效率；使用PEG降低DNA剪切力損傷，保證DNA的完整性；從而使得血漿游離DNA的提取無抑制劑殘留、提取質(zhì)量高、操作簡便、成本低廉。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，生物樣本前處理技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種氨基酸緩沖液及血漿游離 DNA提取試劑盒。

背景技術(shù)

cfDNA是一種片段化的胞外DNA，主要存在于血漿、血清、腦脊液等體液中，長度在幾十到幾百個堿基。目前cfDNA主要應(yīng)用領(lǐng)域是無創(chuàng)產(chǎn)前診斷和腫瘤液態(tài)活檢。隨著cfDNA應(yīng)用越來越廣泛，cfDNA的提取顯得十分重要，cfDNA的提取包括核酸與蛋白質(zhì)的分離、核酸的吸附、去除蛋白等雜質(zhì)、核酸洗脫。

目前提取cfDNA多使用酚-氯仿法、磁珠法和硅膠膜吸附柱法。酚-氯仿等試劑對人體有 傷害，且提取效率低、重復(fù)性差。磁珠法通常是在磁珠表面修飾不同的配體，如抗體、抗原、 寡核苷酸或適配體，這些配體與樣品中的目標(biāo)特異性結(jié)合。然后，在容器或管的一側(cè)施加磁 鐵，對磁珠進(jìn)行吸附，經(jīng)過洗滌、洗脫，得到純化的核酸。磁珠提取技術(shù)可用于多種樣本的 批量處理，是自動化、高通量的最佳選擇之一，但是核酸純度較低，常影響下游應(yīng)用(酶切、 PCR等)。硅膠膜吸附柱法是結(jié)合特定的緩沖溶液、精確的pH和鹽濃度實現(xiàn)對核酸的吸附。 研究發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，硅基質(zhì)對DNA具有較高的結(jié)合親和力，且隨著鹽濃度增加而增 加，這項技術(shù)涉及的機(jī)制是帶負(fù)電荷的核酸和帶正電荷的二氧化硅材料之間的親和力，導(dǎo)致 核酸選擇性地結(jié)合到二氧化硅基質(zhì)上，而細(xì)胞的其余成分和其他化學(xué)物質(zhì)則被沖走。該方法 快速、核酸純度高、重現(xiàn)性好，其主要缺點是對小片段核酸的提取效率較磁珠法低，且常用 離液鹽條件，對后續(xù)的鹽分洗滌比較繁瑣、冗長。柱提法還存在的一個嚴(yán)重的問題是高速離 心造成的剪切力，容易降解DNA，影響DNA的完整性。目前市場上主要的硅膠膜吸附柱法 提取游離核酸的產(chǎn)品是Qiagen公司的試劑盒，不但價格較昂貴，而且回收率僅約40％。因此 中國市場急切地需要一種無毒無害、無抑制劑殘留、不影響DNA結(jié)構(gòu)、價格廉價、高提取 率、高品質(zhì)的cfDNA提取試劑盒。

二氧化硅表面的類型在吸附的DNA總量中起著重要作用，對于給定的二氧化硅表面， 帶正電荷的氨基酸促進(jìn)DNA吸附，而帶負(fù)電的氨基酸幾乎沒有促進(jìn)作用。核酸的有效洗脫 與吸附同樣重要，在較高的pH條件可通過增加二氧化硅表面上的負(fù)電荷密度，增加DNA和 二氧化硅表面之間的靜電排斥，從而促進(jìn)DNA洗脫。有研究顯示，氨基酸緩沖液與高濃度離液鹽的作用相當(dāng)，但是沒有明確的文獻(xiàn)闡述氨基酸結(jié)合低濃度離液鹽在促進(jìn)核酸吸附中的 作用。

PEG的性質(zhì)穩(wěn)定，無毒無害，耐熱、酸堿，具有潤滑性和粘結(jié)性。根據(jù)分子不同具有不 同的物理性質(zhì)，分子量在700及以下的PEG呈無色無味、粘稠狀，可使用不同相對分子質(zhì)量 的PEG改變?nèi)軇┑恼扯?Mr2000)，作為粘度調(diào)節(jié)劑。聚乙二醇水溶液的粘度對剪切速率較敏感，細(xì)菌不易在聚乙二醇上生長。PEG可誘導(dǎo)水溶液中大分子的聚集，增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解，同時具有沉淀核酸的作用，常用于沉淀 病毒顆粒，還不曾用于cfDNA的提取。

針對上述存在技術(shù)難題，本發(fā)明創(chuàng)新性地探究氨基酸與低濃度的離液鹽結(jié)合，同時嚴(yán)格 控制緩沖液的pH值對提高提取效率的影響；探究低分子量聚乙二醇在降低DNA剪切力損傷 中的作用。為市場尋找到一種提取方法可以替代高濃度離液鹽條件并可以高效地促進(jìn)硅膠膜 對小片段DNA的捕獲能力，增大cfDNA提取效率，同時保證DNA的完整性，無抑制劑殘 留、提取的cfDNA質(zhì)量高、操作簡便、成本低廉。

發(fā)明內(nèi)容