[發明專利]一種通過桃兒七愈傷不定根生產鬼臼毒素的方法

有效

• 申請號: 201910331392.2
• 申請日: 2019-04-24
• 公開（公告）號: CN110050698B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 楊濤;王治業;楊暉;李鑫;李珊;方彥昊
• 申請（專利權）人: 甘肅省科學院生物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

1.一種通過桃兒七愈傷不定根生產鬼臼毒素的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）獲取無菌種胚：將新鮮的桃兒七種子消毒，取出無菌種胚；

（2）胚性愈傷組織誘導：將上述種胚接種于胚性愈傷組織誘導培養基，黑暗條件下，23℃培養40天左右，至明顯看到帶有不定根根原基的胚性愈傷組織，獲得外植體；

胚性愈傷組織誘導培養基配方: MS基本培養液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、瓊脂5g/L、生物素0.2 mg/L、吲哚乙酸2-4mg/L、玉米素2-4mg/L、油菜素內酯0.01-0.05 mg/L、毒莠啶2 mg/L；

（3）不定根的生長：將上述外植體轉接入不定根生長培養基，黑暗條件下，20℃培養40天，至不定根長度5cm；

不定根生長培養基配方：1/2MS基本培養液、蔗糖20g/L、瓊脂5g/L、萘乙酸濃度為0.2mg/L、吲哚乙酸濃度為0.2mg/L；

（4）鬼臼毒素的誘導生產：將上述不定根接入鬼臼毒素誘導培養基，黑暗條件下，20℃培養7天，收集不定根，洗凈烘干后，用體積比1:1的甲醇/氯仿混合液超聲提取1h，過濾，揮干，甲醇定容，即為鬼臼毒素提取液；

鬼臼毒素誘導培養基配方： 1/2MS基本培養液、蔗糖20g/L 、粉紅粘帚霉發酵液接種量為體積比20%；

其中粉紅粘帚霉為fhnzm，保藏號為CGMCC No.17070，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心；

粉紅粘帚霉發酵液制備：將粉紅粘帚霉接入PDA培養基，30℃，160r/min振蕩培養，培養9 d后取樣，培養物經濾紙過濾，濾液3000 r/min離心15 min，上清液經 0.22 μm 濾膜過濾，收集濾液-20℃保存備用。

2.根據權利要求1所述的通過桃兒七愈傷不定根生產鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步驟(1)無菌種胚的取出方法是將種胚從種臍部的萌發孔中擠出。

3.根據權利要求1所述的通過桃兒七愈傷不定根生產鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步驟（2）中吲哚乙酸為3mg/L，玉米素為3mg/L，油菜素內酯為0.03mg/L。

4.根據權利要求1所述的通過桃兒七愈傷不定根生產鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步驟（2）胚性愈傷組織誘導培養基配方中的毒莠啶2 mg/L用2,4-二氯苯氧基乙酸2 mg/L代替。

5.根據權利要求1所述的通過桃兒七愈傷不定根生產鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步驟（2）胚性愈傷組織誘導培養基配方中的毒莠啶2 mg/L用獨腳金內酯0.2-0.8 mg/L代替。

6.根據權利要求1所述的通過桃兒七愈傷不定根生產鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步驟（4）鬼臼毒素誘導培養基配方中的粉紅粘帚霉發酵液接種量為體積比20%替換為茉莉酸甲酯3 mg/L。

7.根據權利要求1所述的通過桃兒七愈傷不定根生產鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步驟（4）鬼臼毒素誘導培養基配方中的粉紅粘帚霉發酵液接種量為體積比20%替換為冠菌素0.01-0.1 mg/L。

8.根據權利要求4所述的通過桃兒七愈傷不定根生產鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步驟（2）中吲哚乙酸為3mg/L，玉米素為3mg/L，油菜素內酯為0.03mg/L。

9.根據權利要求5所述的通過桃兒七愈傷不定根生產鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步驟（2）中吲哚乙酸為3mg/L，玉米素為3mg/L，油菜素內酯為0.03mg/L，獨腳金內酯為0.5mg/L。

10.根據權利要求7所述的通過桃兒七愈傷不定根生產鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步驟（4）中冠菌素為0.05mg/L。