[發(fā)明專利]一種三維可折疊芯片鄰近雜交-電化學(xué)發(fā)光基因檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910326207.0
• 申請日: 2019-04-23
• 公開（公告）號: CN110042149B
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 章春筍;蘇妍
• 申請（專利權(quán)）人: 華南師范大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6837
• 分類號: C12Q1/6837
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 郭煒綿

1.一種基于三維可折疊芯片的非疾病診斷或治療目的的基因檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)設(shè)計(jì)探針和輔助DNA序列

針對要檢測的腫瘤特征基因，選取其特征片段作為靶DNA，即T-DNA；

設(shè)計(jì)捕獲發(fā)夾探針DNA，即HP-DNA，以及兩條輔助DNA，即H-DNA1和H-DNA2的序列；

上述4條DNA序列需滿足以下條件：

H-DNA1的5’端與T-DNA的3’端互補(bǔ)；

H-DNA1的3’端與HP-DNA的5’端互補(bǔ)；

H-DNA1的中間序列與H-DNA2的中間序列互補(bǔ)；

H-DNA2的5’端與HP-DNA的3’端互補(bǔ)；

H-DNA2的3’端與T-DNA的5’端互補(bǔ)；

所述的HP-DNA，其3’端連接氨基；

(2)形成PH復(fù)合物

將H-DNA1、H-DNA2和待測樣品加入緩沖液中，孵育反應(yīng)數(shù)分鐘，若待測樣品含有T-DNA的話，就會形成PH復(fù)合物；

(3)芯片折疊前傳感界面制備和上樣

將多壁碳納米管-殼聚糖(MWCNTs-CS)溶液滴加在可折疊三維芯片的工作電極表面，室溫下放置數(shù)分鐘；

將戊二醛溶液滴加在可折疊三維芯片的工作電極上，室溫下反應(yīng)后用去離子水沖洗；接著將HP-DNA滴加到已修飾GA的工作電極表面上，在恒溫恒濕條件下反應(yīng)數(shù)分鐘，然后采用Tris–HCl緩沖液沖洗、室溫下晾干；最后，牛血清蛋白封閉緩沖液滴加到已修飾HP-DNA工作電極表面上，在室溫下孵育后用PBS緩沖液沖洗，從而制得芯片傳感界面；

將等體積的PH復(fù)合物溶液與三聯(lián)吡啶釕溶液均勻混合后滴加到上述制得的傳感界面上，在恒溫且恒濕下孵育，接著用沖洗緩沖液沖洗，室溫下干燥；

(4)芯片折疊后樣品檢測

沿著折疊線將可折疊三維芯片折疊，使樣品池與輔助池重疊構(gòu)成可進(jìn)行PH-ECL檢測的三電極結(jié)構(gòu)；然后，在輔助池滴加三丙胺溶液，待樣品池中工作電極浸透后將芯片放入暗箱中；最后，啟動CCD自動成像功能，并緊接著啟動恒電位儀，若待測樣品中含有要檢測的腫瘤特征基因，則會觸發(fā)PH-ECL反應(yīng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于：步驟(1)所述H-DNA1與H-DNA2的互補(bǔ)堿基對數(shù)為8bp。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于：步驟(1)所述的腫瘤特征基因包括K-ras基因和p53基因。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于：步驟(3)所述的可折疊三維芯片為布襯底。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于：步驟(3)中，所述多壁碳納米管-殼聚糖溶液中多壁碳納米管(MWCNTs)的濃度為5g/L。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于：步驟(3)中，所述HP-DNA的濃度為0.5μM。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于：步驟(3)中，所述三聯(lián)吡啶釕溶液的濃度為1mM。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于：步驟(3)中，所述的孵育，其時間為40min。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于：步驟(4)中，所述三丙胺溶液的濃度為20mM。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因檢測方法，其特征在于：步驟(4)中，CCD實(shí)時采集的發(fā)光視頻保存成WMA格式；使用VGIF軟件將視頻變成JPG圖片格式；然后，使用nEO iMAGING4.4.1截取工作電極發(fā)光區(qū)域；最后通過Matlab R2012a測量圖片平均灰度值并使用Origin7.0軟件對成像數(shù)據(jù)作分析處理。