[發(fā)明專利]一種微藻總核糖核酸樣品制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910324052.7
• 申請日: 2019-04-22
• 公開（公告）號: CN111826373A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發(fā)明（設計）人: 薛松;范旭冉;曹旭鵬;樸海龍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發(fā)明涉及一種微藻總核糖核酸(RNA)樣品制備技術(shù)，具體的說是對于高糖能源微藻特點而開發(fā)的一種總RNA提取純化方法。本發(fā)明以微藻生物質(zhì)為原料，經(jīng)過液氮研磨、均相試劑提取和純化，最終獲得滿足高通量測序所需要的總RNA樣品。本發(fā)明操作簡單，尤其適用高糖微藻總RNA樣品制備。

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，涉及微藻總RNA的提取方法，尤其適用于從高糖微藻樣品提取總RNA用于轉(zhuǎn)錄組學的研究。

背景技術(shù)

微藻因其生長快速、可通過簡單培養(yǎng)調(diào)節(jié)代謝通路，定向富集儲能物質(zhì)而成為新一代天然、低成本并且綠色環(huán)保的能源原料、工業(yè)原料或食品原料。在對微藻代謝通路調(diào)控機制的研究中，轉(zhuǎn)錄組測序是一種高效、經(jīng)濟的技術(shù)手段，近年來已在微藻研究領域中被廣泛應用。通過轉(zhuǎn)錄組信息可以對微藻細胞中基因在特定環(huán)境與時間下的轉(zhuǎn)錄情況進行定性與定量，但轉(zhuǎn)錄組測序需要高質(zhì)量的RNA樣品才能準確的展現(xiàn)細胞在特定時間階段的轉(zhuǎn)錄情況。

高糖微藻細胞中富含多種多糖。多糖與RNA的多個理化性質(zhì)相似，在沉淀RNA時，多糖往往會與RNA共同沉淀，形成富含多糖的凝膠狀RNA沉淀，并會形成大量的掛壁。去除多糖的過程中，部分RNA容易被一同去除，從而降低RNA的得率，而增加的步驟又給總RNA增加了很大的降解風險。尤其在脅迫環(huán)境下培養(yǎng)的微藻，細胞本身的RNA已經(jīng)開始降解，長時間的提取與純化步驟會進一步降低樣品質(zhì)量，所產(chǎn)生的差異會在后續(xù)測序過程中的PCR倍增步驟中被進一步放大，使得轉(zhuǎn)錄組測序的定量出現(xiàn)顯著誤差。另外，多糖會抑制部分酶的活性，同樣會對后續(xù)的建庫與測序產(chǎn)生干擾。

本發(fā)明基于酚類及異硫氰酸胍等試劑提取細胞總RNA的技術(shù)，從新鮮收集或低溫保存的高糖微藻細胞中提取總RNA，可直接用于轉(zhuǎn)錄組測序的建庫，是一種高效、簡潔的獲取高質(zhì)量RNA樣品的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為高糖微藻細胞中提取總RNA質(zhì)量不高，提取率較低的問題，提供了一種微藻總RNA樣品制備技術(shù)，本發(fā)明所屬方法可以高效、簡潔的獲取高質(zhì)量RNA樣品。

本發(fā)明提供一種微藻總RNA樣品制備技術(shù)，包括以下步驟：

①在即將使用的研缽中加入2/3體積的液氮，等待液氮完全蒸發(fā)；②將藻泥樣品在融化前置于研缽中，加入少量液氮，在液氮中將藻沉淀磨成粉末狀，過程中需再加1-2次液氮；③按照100mg藻沉淀/1mL TRIzol比例加入TRIzol(Ambion-Life Technologies Co.,Carlsbad,CA,USA)將藻粉覆蓋住，然后加入少量液氮使其變固體，并在室溫融化，融化過程中在膏狀時用研杵充分攪拌；④完全融化后用研杵混勻樣品與試劑，每1000μL轉(zhuǎn)移至一個新的1.5mL離心試管中，12000g離心5min，取上清750μL，完全不吸入破碎物；⑤每個離心管加入150μL體積的氯仿，手振15s，室溫靜置5min，之后12000g離心15min；⑥取上清，完全不觸碰到中間層，留有較大距離以防吸入，加入375μL的異丙醇，混勻，室溫靜置10min，12000g離心10min，棄上清；⑦加入1mL 75％乙醇，上下顛倒清洗沉淀，12000g離心5min，盡可能的去除乙醇；⑧室溫干燥2-5min，用100μL DEPC-H₂O依次溶解20min后，分別定量和瓊脂糖凝膠電泳驗證。

本發(fā)明關鍵操作內(nèi)容注意事項包括：

(1)操作環(huán)境干凈無塵，事先用DNARNase Away處理，嚴格戴好口罩、頭套、手套；

(2)移液器桿、實驗臺面徹底處理，槍頭、離心管等耗材、試劑均采用無RNase的耗材與試劑；

(3)樣品加入TRIzol后的凍融過程可以提高RNA提取率；

(4)去除乙醇步驟中，按順序分別使用1000μL，100μL，10μL移液器盡量去除乙醇，可以顯著降低RNA樣品中鹽含量。