[發明專利]一種組織中泰樂菌素殘留的檢測方法

在審

• 申請號: 201910323647.0
• 申請日: 2019-04-22
• 公開（公告）號: CN109932460A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 袁宗輝;郝海紅;黃安雄;黃玲利;王旭;彭大鵬;陳冬梅;陶燕飛;王玉蓮;潘源虎;謝書宇;程古月;瞿瑋
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 戴鳳儀

1.一種組織中泰樂菌素殘留的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟1、制備供試品樣品：

(1)將稱量好的組織用淋洗溶劑淋洗，勻漿，提取，渦旋，超聲，離心處理，得到上清液；

(2)重復上述提取步驟一次，第二次離心處理，合并兩次上清液；

(3)在步驟(2)得到的上清液中加入蛋白沉淀劑，渦旋，離心，取上清液，蒸干，得到殘渣；

(4)用有機溶劑溶解步驟(3)中的殘渣兩次，合并兩次溶解液；

(5)HLB固相萃取小柱凈化；

(6)氮氣吹干洗脫液，加流動相溶解殘渣，過濾溶解液，經HPLC檢測濾液，制成供試品樣品；

步驟2、繪制標準曲線

取泰樂菌素標準儲備液，用流動相依次稀釋成10ppm、5ppm、2ppm、1ppm、0.5ppm、0.2ppm和0.1ppm的標準工作品溶液，用HPLC檢測，每種濃度每天重復測定5次，重復操作5天，將所得峰面積均值與對應濃度作線性回歸，繪制標準曲線并得到線性回歸方程和相關系數；

步驟3、測定

吸取上述標準工作品溶液和供試品樣品進行檢測，根據外標法計算泰樂菌素殘留量；采用高效液相色譜儀對組織中殘留的泰樂菌素進行檢測。

2.根據權利要求1所述的一種組織中泰樂菌素殘留的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、制備供試品樣品：

(1)用淋洗溶劑將組織淋洗干凈，5000r/min勻漿5min，然后將組織置于50mL離心管中，加入提取劑，渦旋5～6min，超聲10min，4℃，4000r/min離心10min，取上清液于另一離心管中；

(2)重復提取步驟一次，第二次10000r/min離心，合并兩次上清液；

(3)將步驟(2)得到的上清中液加入0.5mL蛋白沉淀劑，渦旋2min，4℃，10000r/min離心10min，取上清液于旋轉蒸發瓶中，置于旋轉蒸發儀上蒸干，得到殘渣；

(4)用有機溶劑溶解步驟(3)中的殘渣兩次，合并兩次溶解液；

(5)HLB固相萃取小柱凈化，HLB小柱凈化過程如下：HLB柱先依次用3mL甲醇、3mL水活化，將上述溶解液傾倒至HLB柱中，控制流速小于3mL/min，用3mL5％氨水、3mL水先后淋洗，抽干，6mL乙腈洗脫，收集洗脫液；

(6)置45℃氮氣吹干，加流動相1mL溶解殘渣，溶解液過0.22μm有機濾膜，濾液經HPLC檢測；

步驟2、繪制標準曲線

取泰樂菌素標準儲備液，用流動相依次稀釋成10ppm、5ppm、2ppm、1ppm、0.5ppm、0.2ppm和0.1ppm的標準工作品溶液，用HPLC檢測，每種濃度每天重復測定5次，重復操作5天，將所得峰面積均值與對應濃度作線性回歸，繪制標準曲線并得到線性回歸方程和相關系數；

步驟3、測定

吸取上述標準工作品溶液和供試品樣品進行檢測，根據外標法計算泰樂菌素殘留量；采用高效液相色譜儀對組織中殘留的泰樂菌素進行檢測。

3.根據權利要求2所述的一種組織中泰樂菌素殘留的檢測方法，其特征在于：所述淋洗溶劑為3mL體積分數5％氨水、3mL水。

4.根據權利要求2所述的一種組織中泰樂菌素殘留的檢測方法，其特征在于：所述提取劑為乙腈。

5.根據權利要求2所述的一種組織中泰樂菌素殘留的檢測方法，其特征在于：所述組織與提取劑的料液比為1:4。

6.根據權利要求2所述的一種組織中泰樂菌素殘留的檢測方法，其特征在于：所述流動相為0.1M的甲酸銨-乙腈混合液。

7.根據權利要求2所述的一種組織中泰樂菌素殘留的檢測方法，其特征在于：所述蛋白沉淀劑為體積分數為10％的乙酸鋅溶液。

8.根據權利要求2所述的一種組織中泰樂菌素殘留的檢測方法，其特征在于：步驟(4)中所述有機溶劑為體積分數為的2％偏磷酸和體積分數為20％甲醇的水溶液。