[發(fā)明專利]一種利用共表達(dá)反式茴香腦單加氧酶和甲酸脫氫酶重組工程菌生產(chǎn)胡椒醛的方法及其工程菌

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910321978.0
• 申請(qǐng)日: 2019-04-22
• 公開（公告）號(hào): CN111826332B
• 公開（公告）日: 2022-12-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭璞;文鵬;吳丹;陳鵬程
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12P17/04;C12R1/19
• 代理公司: 南京禹為知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32272
• 代理人: 王江南

1.一種利用共表達(dá)反式茴香腦單加氧酶和甲酸脫氫酶重組工程菌生產(chǎn)胡椒醛的方法，其特征在于：包括，

甲酸脫氫酶基因fdh與反式茴香腦單加氧酶基因tao或其突變體基因共表達(dá)重組載體的構(gòu)建；

重組基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)；

利用所述重組基因工程菌生產(chǎn)胡椒醛；

其中，所述重組載體以pETDuet-1質(zhì)粒為基礎(chǔ)；反式茴香腦單加氧酶基因tao的核苷酸序列如SEQ ID NO.2；反式茴香腦單加氧酶基因tao突變體基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3；甲酸脫氫酶基因fdh來源于博伊丁假絲酵母Candida boidinii；

所述甲酸脫氫酶基因fdh，經(jīng)過密碼子優(yōu)化后，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述利用重組基因工程菌生產(chǎn)胡椒醛，為經(jīng)過所述重組基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)后，以所述重組基因工程菌為生物催化劑，以黃樟油素為底物，甲酸鈉為輔底物，pH 3～9緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在20～40°C、50～240rpm條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化0.5～12h。

2.如權(quán)利要求1所述的利用共表達(dá)反式茴香腦單加氧酶和甲酸脫氫酶重組工程菌生產(chǎn)胡椒醛的方法，其特征在于：所述甲酸脫氫酶基因fdh與所述反式茴香腦單加氧酶基因tao或其突變體基因以串聯(lián)的方式連接到pETDuet-1載體，甲酸脫氫酶基因fdh位于pETDuet-1載體的第一個(gè)多克隆位點(diǎn)MSC1，所述反式茴香腦單加氧酶基因tao或其突變體基因位于pETDuet-1載體的第二個(gè)多克隆位點(diǎn)MSC2。

3.如權(quán)利要求1或2所述的利用共表達(dá)反式茴香腦單加氧酶和甲酸脫氫酶重組工程菌生產(chǎn)胡椒醛的方法，其特征在于：所述重組基因工程菌來源于E.ColiBL21(DE3)。

4.如權(quán)利要求1或2所述的利用共表達(dá)反式茴香腦單加氧酶和甲酸脫氫酶重組工程菌生產(chǎn)胡椒醛的方法，其特征在于：所述重組基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)，為將甲酸脫氫酶基因fdh與反式茴香腦單加氧酶基因tao或其突變體基因共表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)入E .ColiBL21(DE3)菌株，之后接種于含有30～100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37°C過夜培養(yǎng)獲得種子液；再將種子液以2-5％的接種量接種于含有30～100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至OD 600nm為0.5～1 .8，添加終濃度為0.1～1mmol/L IPTG，在16-28°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)6～10h，離心，收集菌體細(xì)胞。

5.如權(quán)利要求1所述的利用共表達(dá)反式茴香腦單加氧酶和甲酸脫氫酶重組工程菌生產(chǎn)胡椒醛的方法，其特征在于：所述利用重組基因工程菌生產(chǎn)胡椒醛，其反應(yīng)體系中，所述底物濃度為20g/L，輔底物濃度為40g/L，所述生物催化劑用量以菌體濕重計(jì)為10～100g/L。

6.如權(quán)利要求1所述的利用共表達(dá)反式茴香腦單加氧酶和甲酸脫氫酶重組工程菌生產(chǎn)胡椒醛的方法，其特征在于：所述胡椒醛產(chǎn)量15 .91g/L、轉(zhuǎn)化率為79.55％、時(shí)空轉(zhuǎn)化率為2.27g/L/h。

7.權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的共表達(dá)反式茴香腦單加氧酶和甲酸脫氫酶的重組工程菌。