[發明專利]基于雜交、延伸連接反應的核酸捕獲文庫制備方法

在審

• 申請號: 201910318823.1
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN110241177A
• 公開（公告）日: 2019-09-17
• 發明（設計）人: 馬曉玲;劉冬梅
• 申請（專利權）人: 上海三譽華夏基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 郭磊

本發明公開了基于雜交、延伸連接反應的核酸捕獲文庫制備方法，屬于核酸檢測技術領域。本發明通過設計捕獲探針引物，然后與基因組DNA進行雜交反應，得到目的DNA片段后進行延伸、連接反應，后對目的DNA片段進行PCR擴增，純化后即可進行文庫測序。本發明的靶向區域捕獲建庫方法比較靈活，特異性高，捕獲效率高，操作簡單，耗時較短，并且能夠盡量減少因PCR擴增效率差異造成的捕獲區域均一性很差的現象。

技術領域

本發明涉及一種基于雜交、延伸連接反應的核酸捕獲文庫制備方法，屬于核酸檢測技術領域。

背景技術

高通量測序技術發展后測序成本降低，但測序之后的龐大的數據量分析工作難度加大。測序深度更高后導致測序的數據量越來越大，分析工作也是越來越困難。近年來測序技術的發展逐漸形成了兩個方向：大而全的全基因組測序 (Whole Genome Sequencing)和小而精的靶向捕獲測序(Target Capture Sequencing)。

與全基因組測序相比，捕獲測序可以針對感興趣的區域進行分離與富集，可以大大降低后續的數據分析工作。在遺傳突變、腫瘤篩查等領域，靶向捕獲所能達到的靈敏度也是全基因組測序完全無法實現的。由于捕獲測序在測序前就對基因的目標區域進行了分離與富集，目標區域的大幅減少可實現5000×甚至更高的測序深度。測序深度的提高意味著更高的靈敏度(能夠檢測低頻率的變異)，其檢測極限低至0.1％。靶向捕獲方法主要包括雜交捕獲、分子倒置探針以及多重PCR。

雜交捕獲根據核酸分子堿基互補雜交原理，設計分子探針。探針可以和目標區域通過堿基互補配對結合，從而將目標區段捕獲。非捕獲區域會被洗脫丟棄，之后通過變性(一般是調節PH值到堿性)將探針和捕獲區段分開，被捕獲的片段即可進行二代測序。一般來說，雜交捕獲根據探針狀態的不同分為固態雜交和液態雜交。優點是捕獲的區段大，均一性好，缺點是特異性差。因為樣本是隨機打斷，捕獲時候可能與部分目的區段雜交，導致含有部分目的區段的片段被捕獲。

分子倒置探針(MIP)技術優勢是特異性好而且捕獲完成后的片段直接完成了建庫(雜交捕獲后還需要構建測序文庫，主要是添加Index和測序接頭)。其原理是設計一個口袋狀探針，H1和H2能和目標區段退火，然后利用DNA 聚合酶將探針缺口補齊，同時添加DNA連接酶，將缺口處磷酸二酯鍵連接，即可構成一個完整的環狀探針。然后通過外切酶將游離的探針消化，完整的探針包括目標區段的序列，利用通用序列作為后續文庫構建的引物(可添加index 和測序引物)，擴增產物可以直接作為二代測序文庫。優點是特異性高，但是缺點是捕獲效率不高。

多重PCR富集是目前應用比較廣泛的，適合大規模樣本的捕獲方法，主要以Life公司和Illumina公司的兩種方法為主：Ion Ampliseq最關鍵之處在于引物設計，該公司設計的引物可以滿足1000-2000重單管反應。優點：方法簡單，起始量低至10ng，在PCR產物以及石蠟樣本中有明顯優勢。難點：引物池是需要豐富的引物設計經驗，目前只有thermo做的好，并且將經驗做成了軟件，登陸www.ampliseq.com提交序列即可。Illumina公司的方法：針對目標區段設計兩段探針，探針和DNA雙鏈中的一條鏈雜交，通過DNA聚合酶和DNA連接酶的作用，將探針中間的缺口補齊。上下游探針攜帶有通用序列，之后利用攜帶通用序列的建庫引物(index和測序引物等)進行擴增以后即完成建庫。優點是保證多個擴增子擴增效率的一致性，缺點是連接反應操作繁瑣，并且對起始模板濃度要求比較高。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供一種基于雜交、延伸連接反應的核酸靶向捕獲測序文庫制備方法，開發一種比較靈活的，操作簡單，耗時較短的靶向區域捕獲建庫方法，盡量減少因PCR擴增效率差異造成的捕獲區域均一性很差的現象。

本發明的第一個目的是提供一種基于雜交、延伸連接反應的核酸靶向捕獲測序文庫制備方法，包括如下步驟：