[發明專利]水解酶基因ameH及其編碼的蛋白和應用

有效

• 申請號: 201910318818.0
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN110055268B
• 公開（公告）日: 2022-01-14
• 發明（設計）人: 洪青;張晨飛;姜萬奎;邱吉國;閆新;何健
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/14;C12N15/70;C12N1/21;B09C1/10;C02F3/34;C12R1/19;C02F101/38;C02F101/34;C02F101/30
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

本發明公開了水解酶基因ameH及其編碼的蛋白和應用。本發明水解酶基因ameH全長為951bp，序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼產物水解酶AmeH含316個氨基酸，序列為SEQ ID NO.2。AmeH能降解滅多威殺蟲劑。水解酶AmeH可用于降解土壤、水體中滅多威的殘留，具有非常重要的理論和應用價值。

技術領域

本發明屬于應用環境微生物和農業領域，涉及水解酶基因ameH及其編碼的蛋白和應用，具體涉及降解肟類氨基甲酸酯類農藥——滅多威的水解酶基因ameH和其應用。

背景技術

氨基甲酸酯類農藥是與有機磷、擬除蟲菊酯并駕齊驅的三大農藥之一的一類新型廣譜殺蟲、殺螨和除草劑。因有機氯農藥的禁用、限用，及抵抗有機磷農藥的昆蟲種類逐漸增加，氨基甲酸酯類農藥的使用量也隨之越來越大。滅多威是一種廣泛用于農林業的氨基甲酸酯類農藥，除了常見的滅多威劑型作為農藥使用外，還可以與其他多種殺蟲、殺螨劑結合配制成復配劑，如與毒死蜱、阿維菌素、噠螨靈、辛硫磷、氧樂果、吡蟲啉、高效氯氰菊酯等。在棉花、桑茶、果蔬等作物中可以通過抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)而防治雙鱗翅目、鱗翅目、豐翅目等120多種害蟲，且是目前防治抗藥性棉蚜良好的替換品種。我國是農藥生產和使用大國，占殺蟲劑生產總量20％的高毒農藥仍有滅多威，且在市場上依舊活躍。滅多威作為農民常規當家農藥，近年產量穩定。20世紀90年代中期全球銷售額最大的44個農藥品種中，滅多威為其中一員。因此從使用情況來看，滅多威是使用最廣泛的殺蟲劑之一。

滅多威在土壤中吸附能力較弱，遷移性強，水溶性高，因此很有可能會污染地表水或地下水。滅多威對人等哺乳動物具有高毒性，被美國EPA列為I類限制使用農藥。其對環境的生物毒性表現為破壞動物間的捕食關系，威脅生態系統平衡等。除了損壞機體的抗氧化系統、各種器官和干擾內分泌危害外，滅多威還可能具有遺傳毒性。由于滅多威在水中溶解性強、使用量大，加之工農業生產中的不合理排放，導致一些水體和食品中監測到滅多威殘留。滅多威因在環境水體中檢出率高和具有內分泌干擾作用等而被受到廣泛關注。

獲得滅多威降解菌株和降解基因在治理環境中的滅多威殘留有以下作用：(1)用于土壤、水體中殺蟲劑滅多威殘留的消除；(2)通過基因研究構建基因工程菌株，進而研究酶學特性，對滅多威污染修復具有重要意義。因此降解基因在消除該殺蟲劑殘留具有非常重要的理論和應用價值。

發明內容

本發明的目的是提供一種滅多威水解酶基因ameH；

本發明的另一目的是提供該基因編碼的蛋白；

本發明的又一目的是提供該基因的應用；

本發明的目的通過以下技術方案實現：

一個水解酶基因ameH，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。

通過多種蛋白純化和菌株基因組測序相結合的方法來尋找目的基因。首先運用硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱、Q-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱和Sephadex-200凝膠層析等逐步純化菌株MDW-2粗酶液中的滅多威水解酶。Sephadex-200凝膠層析后仍具有滅多威降解活性的蛋白電泳圖(見圖1)，雖然未獲得單一的目的蛋白，但經多條具有酶活性的蛋白條帶分析，初步確定該菌株的滅多威水解酶蛋白大小在30kDa左右。將該條帶送往上海博苑生物科技有限公司進行肽指紋圖譜分析；然后采用高鹽法提取菌株MDW-2基因組，DNA樣品送于凌恩生物科技公司進行基因組測序。通過肽段序列與菌株MDW-2基因組中的氨基酸序列進行同源性比對分析，發現與基因組中scaffold 60的orf06623的氨基酸同源性達到51％，因此對orf06623進行分析，將對應的編碼基因命名為ameH。

所述的水解酶基因ameH編碼的蛋白AmeH，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2。

含有所述的水解酶基因ameH的重組表達載體。