[發明專利]扁穗冰草不同地理種群cpDNAtrnT-trnL多態性研究方法

在審

• 申請號: 201910318351.X
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN110060732A
• 公開（公告）日: 2019-07-26
• 發明（設計）人: 周學麗;土旦加;史德軍
• 申請（專利權）人: 青海省鐵卜加草原改良試驗站
• 主分類號: G16B20/20
• 分類號: G16B20/20;G16B25/20;G16B25/10;G16B30/10;G16B40/00;G16B40/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.扁穗冰草不同地理種群cpDNAtrnT-trnL多態性研究方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)篩選扁穗冰草的6個居群，每個居群地采集多株扁穗冰草幼嫩葉片作為研究對象；

(2)采用改良的CTAB法提取每個扁穗冰草幼嫩葉片的總DNA，即cpDNA；通過測定紫外光吸收值來確定DNA濃度和純度；利用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA完整性；

(3)采用通用引物對獲取的每個扁穗冰草幼嫩葉片cpDNA的trnT-trnL片段進行PCR擴增，獲得多個PCR擴增產物；將所有擴增產物經電泳檢測純化后再測序，獲得每株扁穗冰草幼嫩葉片cpDNA的trnT-trnL擴增片段的核苷酸序列數據；其中，擴增采用的通用引物為：

trnT：5’-CATTACAAATGCGATGCTCT-3’；

trnL：5’-TCTACCGATTTCGCCATATC-3’；

(4)用Clustal X軟件對所有扁穗冰草幼嫩葉片cpDNA的trnT-trnL擴增片段的核苷酸序列對位排列，并加以手工適當校正；

在所有序列校對正確后，用DnaSP4.0程序統計所有cpDNA單倍型，計算各居群的核苷酸多樣性Pi、單倍型多樣性Hd、計算居群間基因流值N_m；

居群內和居群間的基因流用每代雌性個體遷移數F_ST估計，該值由公式F_ST＝1/(1+2N_m)求出，其中N是有效居群大小雌性數目，m是雌性遷移率；

選用Arlequin軟件進行分子方差分析，計算居群內、居群間的變異方差分布；

用MEGA4.1軟件對所有擴增片段的核苷酸組成進行分析；

采用Kitmura-2-Parameter distance雙參數模型計算遺傳距離，并用鄰接法，通過1000次重復獲得的自展檢驗數值標記在分支上。

(5)根據序列比對和數據分析，獲得所述扁穗冰草在不同地理種群cpDNAtrnT-trnL多態性信息，包括序列變異、遺傳多樣性、居群的遺傳結構及居群間系統發育關系信息。

2.如權利要求1所述的扁穗冰草不同地理種群cpDNAtrnT-trnL多態性研究方法，其特征在于，PCR反應體系：總量25μL；內含25mmol/L MgCl₂ 2μL、2.5mmo l/L dNTPs 2μL、10μmol/L引物各0.6μL、25ng模板、10×緩沖液2.5μL、1U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。

3.如權利要求1所述的扁穗冰草不同地理種群cpDNAtrnT-trnL多態性研究方法，其特征在于，PCR擴增程序為：95℃預變性2min，94℃預變性30s，53℃退火45s，72℃延伸1min45s，共5個循環，每個循環退火溫度降1℃；94℃預變性30s，48℃退火45s，72℃延伸1min45s，共30個循環；72℃延伸7min，16℃保溫。

4.如權利要求1所述的扁穗冰草不同地理種群cpDNAtrnT-trnL多態性研究方法，其特征在于，所述序列變異信息具體為：得到18個單倍型，H1～H18；堿基A與T在整個序列中所占比例為71.8％。

5.如權利要求1所述的扁穗冰草不同地理種群cpDNAtrnT-trnL多態性研究方法，其特征在于，所述遺傳多樣性信息具體為：在物種水平上，扁穗冰草Hd＝0.6256，Pi＝0.003068；在居群水平上Hd的變化范圍為0～0.972，Pi變化范圍為0～0.0074。

6.如權利要求1所述的扁穗冰草不同地理種群cpDNAtrnT-trnL多態性研究方法，其特征在于，所述居群的遺傳結構信息為：扁穗冰草91.63％的遺傳變異發生在居群內，8.37％的遺傳變異發生在居群間，居群內的遺傳分化大于居群間的分化，說明群體內變異是扁穗冰草的主要變異來源。

7.如權利要求1所述的扁穗冰草不同地理種群cpDNAtrnT-trnL多態性研究方法，其特征在于，所述居群間的系統發育關系信息為：18個單倍型沒有按地理分布形成明顯的族群，各地理單元中的單倍型相互混雜，沒有明顯的地理分化模式，說明扁穗冰草居群間的基因流較大。