[發(fā)明專利]一種豬肺炎支原體與副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌四聯(lián)滅活疫苗及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910318204.2
• 申請(qǐng)日: 2019-04-19
• 公開（公告）號(hào): CN110124022B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐引弟;王治方;張青嫻;朱文豪;許峰;焦文強(qiáng);李海利;郎利敏;張立憲;游一;王克領(lǐng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): A61K39/02
• 分類號(hào): A61K39/02;A61K39/102;A61K39/09;A61P31/04;C12N1/20;C12R1/35;C12R1/21;C12R1/46;C12R1/01
• 代理公司: 鄭州明華專利代理事務(wù)所(普通合伙) 41162
• 代理人: 高麗華

1.一種豬肺炎支原體與副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌四聯(lián)滅活疫苗，其特征在于：包括滅活的豬肺炎支原體菌株HNMhy1血清型抗原、滅活的副豬嗜血桿菌菌株HNHPS1血清型抗原、滅活的副豬嗜血桿菌菌株HN1570血清型抗原、滅活的豬鏈球菌菌株HNSS1血清型抗原、滅活的胸膜肺炎放線桿菌菌株HNAPP1血清型抗原；

其中：菌株HNMhy1為豬肺炎支原體，于2017年5月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO：13858；菌株HNHPS1為血清4型副豬嗜血桿菌Haemophilus parasuis，于2016年11月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO：13335；菌株HN1570為血清5型副豬嗜血桿菌Haemophilus parasuis，于2018年11月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO：16802；菌株HNSS1為2型豬鏈球菌Streptococcus suis，于2016年11月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO：13334；菌株HNAPP1為1型胸膜肺炎放線桿菌Actinobacilus pleuropneumoniae, 于2016年11月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO：13333。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬肺炎支原體與副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌四聯(lián)滅活疫苗，其特征在于：所述滅活的豬肺炎支原體菌株HNMhy1血清型抗原、滅活的副豬嗜血桿菌菌株HNHPS1血清型抗原、滅活的副豬嗜血桿菌菌株HN1570血清型抗原、滅活的豬鏈球菌菌株HNSS1血清型抗原和滅活的胸膜肺炎放線桿菌菌株HNAPP1血清型抗原的比例為1∶1∶1∶1∶1。

3.一種如權(quán)利要求1所述的豬肺炎支原體與副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌四聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

增殖：將豬肺炎支原體HNMhy1株、副豬嗜血桿菌4型HNHPS1株、副豬嗜血桿菌5型HN1570株、豬鏈球菌2型HNSS1株和胸膜肺炎放線桿菌1型HNAPP1株分別繁殖培養(yǎng)，獲得豬肺炎支原體HNMhy1株、副豬嗜血桿菌HNHPS1株、副豬嗜血桿菌HN1570株、豬鏈球菌HNSS1株和胸膜肺炎放線桿菌HNAPP1株菌液，并分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)；

滅活：分別向步驟a中獲得的豬肺炎支原體HNMhy1株、副豬嗜血桿菌HNHPS1株、副豬嗜血桿菌HN1570株、豬鏈球菌HNSS1株和胸膜肺炎放線桿菌HNAPP1株菌液中按照菌液體積的0.2%加入甲醛溶液，于37℃滅活24h；

濃縮：使用超濾裝置分別濃縮滅活后檢驗(yàn)合格的豬肺炎支原體HNMhy1株、副豬嗜血桿菌HNHPS1株、副豬嗜血桿菌HN1570株、豬鏈球菌HNSS1株和胸膜肺炎放線桿菌HNAPP1株菌液，根據(jù)滅活前的活菌計(jì)數(shù)，用無菌生理鹽水調(diào)整濃縮終濃度為1.0×10¹⁰ CFU/mL；

制備疫苗：

（1）油相的制備：按體積比取注射用白油92份加入油相罐內(nèi)，向罐內(nèi)加入硬脂酸鋁1份，邊加邊攪拌直至完全透明，再加入司本-80 6份，116℃高壓滅菌40min，冷卻至室溫后再加入維生素A和維生素E各0.5份，混合均勻使維生素A和維生素E的濃度均為300IU/Ml，得到油相備用；

（2）水相的制備：將濃縮后獲得的豬肺炎支原體HNMhy1株、副豬嗜血桿菌HNHPS1株、HN1570株、豬鏈球菌HNSS1株和胸膜肺炎放線桿菌HNAPP1株抗原液，按照1∶1∶1∶1∶1的比例混勻配制成抗原液，按體積份比取95份的抗原液，加入滅菌后的吐溫-80 5份，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓玫剿鄠溆茫?/p>

（3）乳化：按照水相和油相1:2的比例，先向乳化罐內(nèi)加入油相，以3000-4000rpm的轉(zhuǎn)速攪拌，再向乳化罐中加入水相繼續(xù)攪拌混合乳化，乳化完成后分裝裝瓶。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種豬肺炎支原體與副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌四聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟a中繁殖培養(yǎng)的操作步驟為：

（1）一級(jí)種子繁殖：將豬肺炎支原體HNMhy1株接種到PPLO固體培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d后收取培養(yǎng)物，副豬嗜血桿菌4型HNHPS1株、5型HN1570株、豬鏈球菌2型HNSS1株和胸膜肺炎放線桿菌1型HNAPP1株凍干菌種分別接種于TSA平板上，37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，挑取符合要求的典型菌落，分別傳代接種于TSA平板上，于37℃培養(yǎng)24小時(shí)，檢驗(yàn)合格后，作為一級(jí)種子；所述TSA平板中添加有終濃度5％的新生牛血清和終濃度0.01%的NAD；

（2）二級(jí)種子繁殖：將豬肺炎支原體和副豬嗜血桿菌4型HNHPS1株、副豬嗜血桿菌5型HN1570株、豬鏈球菌2型HNSS1株和胸膜肺炎放線桿菌1型HNAPP1株一級(jí)種子分別接種到PPLO、TSB液體培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO₂搖床振蕩分別培養(yǎng)3d、18~24小時(shí)，進(jìn)行純粹檢驗(yàn)合格后，作為二級(jí)種子；所述TSB液體培養(yǎng)基中添加有終濃度5％的新生牛血清和終濃度0.01%的NAD；

（3）將豬肺炎支原體和副豬嗜血桿菌4型HNHPS1株、5型HN1570株、豬鏈球菌2型HNSS1株和胸膜肺炎放線桿菌1型HNAPP1株菌株的二級(jí)種子按1％分別接種于PPLO和TSB液體培養(yǎng)基中，分別于37℃，5%CO₂搖床振蕩分別培養(yǎng)3d、18～24小時(shí)后收獲菌液；所述TSB液體培養(yǎng)基中添加有終濃度5％的新生牛血清和終濃度0.01%的NAD。