[發明專利]一種合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法

有效

• 申請號: 201910316885.9
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN110029118B
• 公開（公告）日: 2023-10-10
• 發明（設計）人: 賈紅華;李艷;唐可馨;翁婧媛;嚴明;陳可泉
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/60;C12P19/18;C12R1/19
• 代理公司: 南京新慧恒誠知識產權代理有限公司 32424
• 代理人: 王月霞

1.一種合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法，其特征在于,包括如下步驟：

1）構建具有雙酶體系的重組菌：將糖基轉移酶UGT88A1或其突變體的基因與蔗糖合酶基因連接得到重組質粒，采用熱激法將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞中，得到含雙酶體系的重組菌；

2) 重組菌的誘導產酶：將重組菌接種于LB液體培養基中，25~40℃，取樣，使OD₆₀₀處于0.4～0.5時，使用IPTG作為誘導劑，在16~37℃，150~300r/min的條件下進行誘導12~24h，離心收集菌泥，利用超聲破碎法破碎菌體，離心收集上清，得到粗酶液；

3）將槲皮素溶于DMSO中，加入粗酶液、蔗糖，在20-40℃條件下反應8-30h，使用甲醇終止反應，離心得到槲皮素-4’-葡萄糖糖苷。

2.根據權利要求1所述的合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述糖基轉移酶UGT88A1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其突變體的氨基酸序列是SEQ ID NO.1突變的氨基酸序列，突變的氨基酸位點選自V18，I118，G181，S271中的一個或多個。

3.根據權利要求1所述的合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述蔗糖合酶序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根據權利要求1所述的合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法，其特征在于，誘導劑IPTG的濃度為0.1mM，誘導時長為22h。

5.根據權利要求1所述的合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法，其特征在于，槲皮素溶于DMSO中終濃度為20~40mM；蔗糖終濃度為300~500mM；粗酶液加入量為5～10g/L。

6.根據權利要求2所述的合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法，其特征在于，突變的氨基酸位點發生的突變包括如下任意一種或多種：V18R/K/N，I118G，G181N，S271K其中，“/”表示“或”。

7.一種適用于槲皮素-4’-葡萄糖苷合成的糖基轉移酶突變體，糖基轉移酶突變體的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示發生突變的氨基酸序列，突變的氨基酸位點選V18，I118，G181，S271中的一個或多個。

8.一種表達基因，該基因編碼權利要求7所述的糖基轉移酶突變體。

9.一種重組質粒，該重組質粒連接有權利要求8所述的表達基因和蔗糖合酶基因SUS。

10.一種重組細胞，該重組細胞包含有上述重組表達載體或上述糖基轉移酶突變體的表達基因。