[發(fā)明專利]基因組靶向修飾方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910316583.1
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN110484549B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李文淵;張博;佟向軍;韓冰舟
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/63
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基因組靶向修飾的方法，其包括如下步驟：

(1)在待修飾基因的選定位置處制造雙鏈缺口，其中所述選定位置位于待修飾基因的內(nèi)含子中；

(2)將核酸構(gòu)建體連接入所述雙鏈缺口中；

其中所述核酸構(gòu)建體包含串聯(lián)的元件1和元件2，其中元件1包含可條件性移除的待修飾基因選定位置后的剩余編碼序列C1，從而保證待修飾基因的正常表達(dá)；

所述元件2包含表達(dá)終止信號，其能夠在元件1中所述的剩余編碼序列C1被移除后，終止待修飾基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，從而缺失待修飾基因的內(nèi)源表達(dá)。

(3)任選的，移除元件1中的所述剩余編碼序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中元件1包含位點(diǎn)特異性重組酶的識別位點(diǎn)S1、所述選定位置之后的第一個剪接位點(diǎn)以及選定位置之后所述待修飾基因的剩余編碼序列C1、以及位點(diǎn)特異性重組酶的識別位點(diǎn)S2，其中所述S1和S2能夠在位點(diǎn)特異性重組酶的作用下使兩位點(diǎn)之間的序列被缺失。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中元件2包含1-50個，例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個串聯(lián)的轉(zhuǎn)錄終止信號(TTS)，和/或翻譯終止信號；例如，所述轉(zhuǎn)錄終止信號可以是SV40polyA和/或BGH polyA等。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中步驟(3)包括如下步驟：將能夠識別所述識別位點(diǎn)S1和/或S2的位點(diǎn)特異性重組酶與已連接入所述雙鏈缺口中的所述核酸構(gòu)建體接觸。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中步驟(1)中所述選定位置是ZFN、TALEN或CRISPR/Cas系統(tǒng)的識別位點(diǎn)，具體的，步驟(1)包括下列步驟：將包含待修飾基因的基因組與ZFN、TALEN或Cas以及輔助核酸序列接觸，優(yōu)選的，所述選定位置是CRISPR/Cas(例如CRISPR/Cas9或Cas9/gRNA)的識別位點(diǎn)，所述輔助核酸序列為單鏈向?qū)NA(sgRNA)，或者crRNA(CRISPR-derived RNA)與tracrRNA(trans-activating RNA)形成的tracrRNA/crRNA核酸復(fù)合物。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中步驟(2)中所述連接是非同源末端連接(NHEJ)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述翻譯終止信號是一段包含終止密碼子的核酸序列，優(yōu)選是一段包含有所述選定位置之后第一個剪接位點(diǎn)以及所述選定位置之后第一個外顯子全長或者部分序列的核酸序列，其中在所述外顯子的全長或部分序列中，通過插入、缺失或者點(diǎn)突變的方法引入終止密碼子。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中步驟(2)中所述核酸構(gòu)建體位于載體中，所述載體優(yōu)選為質(zhì)粒載體，優(yōu)選的，所述質(zhì)粒載體為線性化的質(zhì)粒載體。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述線性化是體內(nèi)線性化或者體外線性化。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述體內(nèi)線性化包括如下步驟：在所述載體的所述核酸構(gòu)建體上游引入能夠被切割的位點(diǎn)，將載體引入細(xì)胞內(nèi)，將載體與能夠識別所述切割位點(diǎn)的酶和/或輔助核酸序列接觸。

優(yōu)選的，所述能夠被切割的位點(diǎn)是ZFN、TALEN或CRISPR/Cas的識別位點(diǎn)，并且所述識別位點(diǎn)的序列不存在于所述細(xì)胞的基因組中，相應(yīng)的，所述酶分別為ZFN、TALEN或Cas，例如，所述Cas優(yōu)選為Cas9，所述位點(diǎn)是CRISPR/Cas9的識別位點(diǎn)，優(yōu)選的，所述CRISPR/Cas9的識別位點(diǎn)是hEMX1位點(diǎn)，序列優(yōu)選為GTCACCTCCAATGACTAGGGTGG，或者lamGolden位點(diǎn)，序列優(yōu)選為GGGTCAACGACTTCCTGCACGGG。