[發(fā)明專利]一種定點突變的黑曲霉6-4光修復(fù)酶及其構(gòu)建方法

有效

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• 申請日: 2019-04-17
• 公開（公告）號: CN109971728B
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱國萍;文斌;王勝地;徐蕾;王鵬;黃士平;曹正宇;汪源;卞命杰
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽師范大學(xué)
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12N15/70
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11308
• 代理人: 范奇

本發(fā)明公開了一種定點突變的黑曲霉6?4光修復(fù)酶及其構(gòu)建方法，所述的光修復(fù)酶具有有SEQ ID NO:1，所示的核苷酸序列。本發(fā)明從現(xiàn)有的WT黑曲霉中獲得6?4光修復(fù)酶基因基因序列，進行人工密碼子優(yōu)化之后，設(shè)計突變引物得到突變的基因片段，連接基因片段與pET22b質(zhì)粒，構(gòu)建出重組表達質(zhì)粒；將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞，構(gòu)建出用于光修復(fù)酶表達的基因工程菌在20℃和1mM IPTG條件下獲得了較好的表達。相比于WT光修復(fù)酶，本發(fā)明表達出的突變體酶S460N的活性更高，而且活性保持更加持久穩(wěn)定，能更好的修復(fù)紫外線造成的DNA損傷，更有利于作為化妝品類，醫(yī)藥類產(chǎn)品的添加成分應(yīng)用于人們的生活。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因、蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黑曲霉DNA光修復(fù)酶基因及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人類破壞自然的活動加劇，造成大氣中臭氧層稀薄甚至產(chǎn)生空洞，阻擋紫外線的能力減弱。于是到達地球表面的中波紫外線(UVB，280nm-315nm)劑量逐漸增強，導(dǎo)致人類各種皮膚損傷的發(fā)病幾率大大增加。其原理是UVB能直接被皮膚細胞DNA吸收，引起DNA上兩個相鄰的胸腺嘧啶產(chǎn)生穩(wěn)定共價結(jié)合的二聚體，包括環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)和6-4光產(chǎn)物(6-4photoproduct)，這兩類二聚體破壞DNA正常結(jié)構(gòu)，從而抑制DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，引起細胞內(nèi)信號通路的紊亂，從而造成皮膚疾病甚至是皮膚癌。

光修復(fù)酶是一類在細菌、真菌、植物和動物中都普遍存在，在修復(fù)紫外線造成的DNA損傷中發(fā)揮重要作用的酶。自然條件下CPD與6-4光產(chǎn)物這兩類光致?lián)p傷分別占損傷總量的80-90％和10-20％，分別由CPD光修復(fù)酶和6-4光修復(fù)酶進行修復(fù)。光修復(fù)酶通常是一類單體蛋白，以非共價的形式結(jié)合了1到2種具有發(fā)色團的輔酶，其中一種是FAD，為最常見的黃素輔酶形式。與自然界中利用NADH或是亞鐵血紅素類似，F(xiàn)AD作為電子傳遞的中間體，可以通過得失一個或是兩個電子完成氧化還原反應(yīng)，傳遞電子。FAD主要存在三種基本形式：完全氧化型(oxidized，OX)；單電子還原態(tài)即自由基型(semiquinone，SQ)；雙電子還原態(tài)即完全還原型(hydroquinone，HQ)。在光修復(fù)酶中，必須依賴雙電子還原態(tài)FAD輔酶執(zhí)行功能。

CPD光修復(fù)酶和6-4光修復(fù)酶兩者具有高度同源的氨基酸序列和極其相似的結(jié)構(gòu)，并且反應(yīng)機制也大致相同。含有底物的DNA雙鏈靠近光修復(fù)酶，雙鏈打開，損傷的DNA會深入到光修復(fù)酶的底物結(jié)合口袋，形成一種酶-底物的復(fù)合物。在光照條件下，光修復(fù)酶中完全還原型狀態(tài)(hydroquinone，HQ)的FAD通過直接吸收光子的能量，或是通過第二輔酶傳遞到HQ，形成激發(fā)態(tài)HQ，接著HQ激發(fā)態(tài)上的電子傳遞到DNA損傷底物上，使得二聚體的底物斷裂成正常的胸腺嘧啶，DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)。最后，額外的電子會傳遞到中性自由基狀態(tài)的FADH●，還原為FADH^-，整個修復(fù)過程極其短暫。盡管兩類光修復(fù)酶同源性較高，但是兩類光修復(fù)酶作用底物十分專一，只能修復(fù)特定的底物，而不能互換。

自1999年德國科學(xué)家報道光修復(fù)酶修復(fù)受損人類臀部皮膚的研究后，將光修復(fù)酶作為化妝品的添加成分，逐漸成為防曬產(chǎn)品的主流。以往研究人員對CPD光修復(fù)酶的研究已經(jīng)很充分了，而對于6-4光修復(fù)酶的研究較為稀缺。

發(fā)明內(nèi)容：

根據(jù)以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的第1個技術(shù)問題是提供了一種黑曲霉6-4光修復(fù)酶基因。

本發(fā)明所要解決的第2個技術(shù)問題提供是含有該基因的表達載體。

本發(fā)明所要解決的第3個技術(shù)問題是含有該基因的宿主細胞。

本發(fā)明所要解決的第4個技術(shù)問題是所述光修復(fù)酶的制備方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種定點突變的黑曲霉6-4光修復(fù)酶基因，該6-4光修復(fù)酶具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。