[發明專利]一種真菌感染檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201910315798.1
• 申請日: 2019-04-18
• 公開（公告）號: CN110055300A
• 公開（公告）日: 2019-07-26
• 發明（設計）人: 沈弢;張浩;呂琳婷;鄭佳佳;許強;屠靜;王譽雅
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/72;C12R1/645
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 牛利民;張奎燕

本申請公開一種真菌檢測試劑盒，包括熒光增白劑，活細胞染色劑，固定劑，甘油和NaCl。所述真菌檢測試劑盒應用于檢測體液中的真菌；應用于檢測念珠菌和絲狀菌；應用于白帶檢測以及肺臟、泌尿系統和胸腹腔中的感染性疾病的輔助檢測。本申請通過熒光增白劑染料對白帶霉菌細胞壁的幾丁質和纖維素的特異性熒光染色，在熒光顯微鏡下可以清晰地觀察到霉菌孢子和菌絲的形態，而來自于病人本身的上皮細胞或血細胞不著色；另一方面通過活細胞染色劑進行細胞核染色，確認該形態為細胞形態，從而快速實現對霉菌的高效鑒定。

技術領域

本申請涉及真菌感染檢測領域，具體地涉及一種白帶霉菌熒光染色檢測試劑盒及其應用。

背景技術

近年來，霉菌性陰道炎發病率呈上升趨勢，已取代滴蟲病成為了白帶異常增多最主要的原因之一，嚴重威脅到女性身體健康。目前臨床上實驗室診斷霉菌性陰道炎還主要依靠直接涂片鏡檢，在普通顯微鏡下尋找霉菌孢子和菌絲的感染證據，但缺點在于陽性率太低，有很高比例的患者臨床癥狀符合霉菌感染但鏡檢陰性。常規鏡檢的缺陷主要在于：1)普通顯微鏡下孢子或菌絲形態易與同樣卵圓形的白細胞、紅細胞、脫落上皮細胞或其他干擾物相混淆，難以觀察到典型的菌絲和出芽細胞相連成鏈狀或分枝狀，或聚集的透亮卵圓形孢子結構，給檢驗醫生造成判斷困難；2)由于患者就醫前自主用藥或用藥不規范等因素，很多陽性臨床樣本中霉菌含量很低(只有零星散在的真菌孢子)，讓檢驗科醫生鏡檢缺乏信心無法確診，導致漏診率增加。

目前技術中，使用熒光增白劑28來進行真菌熒光染色。其原理為熒光增白劑28能夠與真菌細胞壁中的幾丁質結合，在熒光顯微鏡下使用UV照射后，真菌細胞壁能夠發射藍色熒光，從而達到真菌檢測的目的，由于臨床微生物中幾丁質主要存在于真菌中，人體細胞、病毒和細菌不含有幾丁質，因此，使用此方法可以較特異性地檢測真菌的感染。該方法步驟主要為：將真菌感染的標本置于載玻片上，將含有熒光增白劑28的試劑滴加到標本上，染色1min后，蓋上蓋玻片，然后置于熒光顯微鏡下進行觀察。可以觀察到真菌菌體發射的藍色熒光。

但是，現有技術中存在的主要問題有：熒光單一，非細胞結構的干擾物被染上熒光后容易干擾觀察；染色后，臨床標本中人體細胞的非特異性熒光干擾結果的觀察；絲狀菌的分生孢子頭的結構不易觀察。

因此，需要能夠容易的在熒光顯微鏡下觀察到真菌的菌體或菌絲；能夠使得樣本中的人體細胞不易干擾真菌的觀察。

發明內容

以下是對本文詳細描述的主題的概述。本概述并非是為了限制權利要求的保護范圍。

本申請通過熒光雙染色的方法，一方面通過熒光增白劑(例如鈣熒光白，calciumfluorescent white)染料對白帶霉菌細胞壁的幾丁質和纖維素的特異性熒光染色，在熒光顯微鏡下可以清晰地觀察到霉菌孢子和菌絲的形態，而來自于病人本身的上皮細胞或血細胞不著色；另一方面通過活細胞染色劑進行細胞核染色，確認該形態為細胞形態，從而快速實現對霉菌的高效鑒定。

具體地，本申請提供一種真菌檢測試劑盒，包括熒光增白劑，活細胞染色劑，固定劑，甘油和NaCl。

在本申請中，所述真菌檢測試劑盒包括0.01％-0.02％質量份的熒光增白劑，0.25μM-0.35μM的活細胞染色劑，55％-60％質量份的固定劑，1％-2％質量份的甘油和20％-28％質量份的NaCl。

在本申請中，μM指的是μmol/L。

在本申請中，所述熒光增白劑為熒光增白劑或熒光染色劑28或CFW，優選地CFW。

在本申請中，所述真菌染色劑可以為CFW，用于真菌細胞壁的熒光染色。CFW染色劑主要與真菌細胞壁成分幾丁質的β-1，4糖苷鍵特異性結合的熒光染色劑，紫外線激發后呈藍色熒光。

在本申請中，所述活細胞染色劑為SYTOX Green、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚或Hoechst。