[發(fā)明專利]一種表達熱穩(wěn)定型酪氨酸酚解酶的大腸桿菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910313671.6
• 申請日: 2019-04-18
• 公開（公告）號: CN109897845B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周景文;堵國成;陳堅;韓紅梅;曾偉主
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N1/21;C12N15/70;C12P13/22;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發(fā)明公開了一種表達熱穩(wěn)定型酪氨酸酚解酶的大腸桿菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以大腸桿菌BL21作為宿主，表達重組質(zhì)粒pET?28(a)?TPL及25個酪氨酸酚解酶突變體，得到了含有突變質(zhì)粒生產(chǎn)L?DOPA的重組大腸桿菌，利用獲得的重組菌全細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L?DOPA，其中表達pET?28(a)?TPL(E313M)的重組菌生產(chǎn)L?DOPA產(chǎn)量達到54.9g/L，相比對照菌株提高了142.9％，其表達的酪氨酸酚解酶的在20℃，40℃，60℃條件下的半衰期分別提高至37.9min，17.1min，14.6min，為代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)L?DOPA奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種表達熱穩(wěn)定型酪氨酸酚解酶的大腸桿菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

左旋多巴(L-DOPA)是氨基酸的一種衍生物，也是從L-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途徑過程中的重要中間產(chǎn)物，又稱3,4-二羥基苯基丙氨酸，是一種重要的活性物質(zhì)。L-DOPA是新型的生化藥品，在食品、醫(yī)藥和保健品等領(lǐng)域都具有廣泛應(yīng)用。L-DOPA的衍生物——多巴胺是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，由于多巴胺不能透過血腦屏障進入腦組織，所以不能通過補充多巴胺來治療帕金森氏病，而L-DOPA可以通過血腦屏障，并在腦組織中脫羧形成多巴胺，從而使腦組織中多巴胺含量增加而達到治療的目的。

Birkmayer于1961年用L-DOPA治療帕金森氏病獲得明顯療效。L-DOPA及復(fù)方L-DOPA(如美多芭)已成為治療常見老年病——帕金森氏病的主要藥物。L-DOPA還可用來治療弱視；利用酪氨酸酶將L-酪氨酸轉(zhuǎn)化，經(jīng)L-DOPA形成黑色素，可用于毛發(fā)染色；此外，人們還發(fā)現(xiàn)L-DOPA有抗衰老的功效。基于L-DOPA在醫(yī)藥衛(wèi)生、保健美容等諸多領(lǐng)域的顯著功效，L-DOPA的生產(chǎn)很早就被人們所關(guān)注。

根據(jù)文獻報道，L-DOPA的制備方法主要有提取法、化學(xué)合成法和酶轉(zhuǎn)化法。

1、提取法

L-DOPA在自然界中主要存在于蠶豆、毛豆等植物中，提取法中免去了與手性異構(gòu)體D-DOPA的拆分工藝，并且L-DOPA的提取得率也相應(yīng)得到了一些提高，但由于受到原料來源少、產(chǎn)量低的限制，因而生產(chǎn)成本高，從植物中提取L-DOPA難以大規(guī)模生產(chǎn)，遠不能滿足市場需求。

陳勇等(中草藥，1993，24(6)：294)用薄層掃描法測定廣西東蘭貓豆M.pruriens，廣西藥用植物園及云南西雙版納藜豆M.macrocarpa Wall中L-DOPA的含量在4.16％～4.94％之間。

劉新民等(中藥材，1994，17(10)：31)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自云南、四川的黎豆屬植物Mucunasempervirens Hemsl中L-DOPA含量為6.65％。

蔣偉哲等(中草藥，2000，31(11)：860)發(fā)現(xiàn)采自廣西宜州市、百色市、北海市、東蘭縣、田東縣五個產(chǎn)地的貓豆中L-DOPA的含量為5.62％～6.83％，而去皮后L-DOPA在種肉中的含量高達6.99％～9.35％，在種皮中的含量僅為0.25％～0.43％。

2、化學(xué)合成法

自從Monsanto團隊(2004，Wiley-VCH Verlag GmbHCo.KGaA，Weinheim，p(21-38))首次采用香草醛和乙內(nèi)酰脲為原料通過不對稱法合成L-DOPA以來，化學(xué)法被廣泛應(yīng)用于L-DOPA的商業(yè)化生產(chǎn)，但化學(xué)合成過程中需要大量的鉛等金屬作為催化劑，并且過程繁雜，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率和對映選擇性均較低，同時具有成本高、環(huán)境污染嚴重等問題。

3、酶轉(zhuǎn)化法

3.1酪氨酸酶