[發(fā)明專利]一種跨膜的饑餓誘導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910312436.7
• 申請日: 2019-04-18
• 公開（公告）號: CN110283251B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李峰;朱偉偉;方倜;張先恩
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院武漢病毒研究所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;A61K38/16;A61P39/06
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所(普通合伙) 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發(fā)明屬于生物科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種跨膜的饑餓誘導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白及應(yīng)用，本發(fā)明通過對來源于原核生物的蛋白納米籠的理性設(shè)計使其成為能夠應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞的抗氧化蛋白納米材料，其特征在于：通過在Dps（Starvation?induced DNA binding protein，Dps）的N端融合表達His?tag和Avitag（LNDIFEAQKIEWHE）實現(xiàn)Dps的跨哺乳動物細(xì)胞膜運輸；并能夠保護細(xì)胞免受活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的損傷；同時該蛋白納米材料生物相容性好，設(shè)計簡單，容易制備，產(chǎn)率高，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種跨膜的饑餓誘導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白及應(yīng)用。

背景技術(shù)

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)是細(xì)胞氧化代謝產(chǎn)生的天然副產(chǎn)物，主要來源于線粒體，包括單線態(tài)氧、超氧根離子、過氧化氫、羥基自由基等。雖然ROS在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、信號傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要功能，但是機體處于復(fù)雜的環(huán)境條件下，很多化學(xué)的、物理的、生物的因素均能引起體內(nèi)活性氧的升高，當(dāng)活性氧含量超過機體的清除閾值時，細(xì)胞內(nèi)過多的ROS可以損傷生物大分子，例如脂質(zhì)的過氧化、蛋白質(zhì)失活、DNA突變等，導(dǎo)致細(xì)胞功能喪失。其中來源于線粒體電子傳遞鏈的超氧根離子，通過歧化反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫又可以通過與金屬離子發(fā)生Fenton反應(yīng)產(chǎn)生最具有破壞性的羥基自由基，因此自由基的產(chǎn)生與機體的微量金屬離子密切相關(guān)。這些金屬元素的含量和價態(tài)在生理條件下被嚴(yán)格的調(diào)控，比如人體微量元素鐵，被機體吸收以后，主要分布在肝臟用于形成血紅素，多余的鐵還可以儲存在鐵蛋白的內(nèi)腔，防止細(xì)胞內(nèi)游離鐵的產(chǎn)生。但是，當(dāng)ROS刺激細(xì)胞產(chǎn)生自噬小體時，自噬小體可以捕獲鐵蛋白然后與溶酶體相結(jié)合，降解鐵蛋白釋放出鐵，3價鐵在溶酶體內(nèi)經(jīng)過酸化轉(zhuǎn)變?yōu)?價參與Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，可以引起鐵依賴的細(xì)胞非凋亡性死亡，并參與多種疾病的病理過程，例如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和癌癥等。

饑餓誘導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白(Starvation-induced DNA binding protein，Dps)是一類可以螯合約500Fe/Dps的迷你鐵蛋白，同時在原核生物中具有H₂O₂的解毒作用和保護DNA的功能；Dps不光可以選擇性的結(jié)合Fe²⁺，還可以響應(yīng)H₂O₂快速地氧化并礦化Fe²⁺來抑制Fenton反應(yīng)減少羥基自由基的產(chǎn)生，因此Dps是一個高效、生物相容性好的抗氧化材料。但是來源于原核生物的Dps蛋白家族的抗氧化功能目前還沒有在哺乳動物細(xì)胞中得到任何應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，野生型的Dps不能跨細(xì)胞膜運輸從而無法在哺乳動物細(xì)胞有效發(fā)揮功能，我們在Dps的外表面融合表達了一段多肽，實現(xiàn)了其高效跨細(xì)胞膜運輸從而在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其抗氧化的功能。

野生型的Dps蛋白在體內(nèi)可以完成自組裝，如果在其N端或C端融合表達其他短肽使其具有跨膜功能，其可能會由于蛋白構(gòu)象問題不能正確組裝；例如，申請人曾嘗試在野生型Dps的N端加上溶酶體逃逸肽H5WYG(GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYG)、HA2(GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG)、HA2TAT(GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRRR)、蜂毒肽(NH2-QQRKRKIWSILAPLGTTLVKLVAGIG-COOH)或者人工合成短肽43E(LAEL-LAEL-LAEL)，蛋白均不能正確組裝；有的即便產(chǎn)生了跨膜功能，但其溶解性和蛋白穩(wěn)定性均會產(chǎn)生影響。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，申請人提供了一種跨膜的饑餓誘導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白，所述的蛋白為Dps的N端或C端依次融合1個Avitag和X個His；或Dps的N端或C端依次融合Y個GGGGS和6個His；所述的X為1～7中的任意自然數(shù)；所述的Y為1或2或3。

本發(fā)明的另一個目的在于提供了跨膜的饑餓誘導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白的應(yīng)用，該融合蛋白可應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)對活性氧的清除，同時拓寬生物抗氧化材料的來源。