[發明專利]一種智能全基因組范圍的植物基因功能鑒定系統及方法

在審

• 申請號: 201910311151.1
• 申請日: 2019-04-18
• 公開（公告）號: CN109971785A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 王超;宋文路;倪飛;薛麗萍;黃廷莉;玄亞男;季彤;閆曉宇
• 申請（專利權）人: 濟寧學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種智能全基因組范圍的植物基因功能鑒定系統及方法，其特征在于：包括以下方法步驟，S1,將含有目標基因的重組質粒轉入到營養培養基中，誘導形成轉基因毛狀，待毛狀生長成新生組織物，

S2，然后將新生的組織物：在6mmol/L PBS中加入3.5％聚乙烯聚吡咯烷酮、2mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、10mmol/L乙二基二硫代氨基甲酸酯；然后進行離心加工，離心力設為800g，時間控制為15min，再取上清，過0.2um濾膜，其次進行透析；

S3，然后切取0.32mm膜，將膜置于100％葡萄糖中10s，充分浸透后膜變為半透明狀，然后進行振搖3min；

S4，利用標記探針對其進行標記，然后再利用DNA探針插入檢測的膜片內部，同時放入同位素、生物素或熒光染料；

S5，再利用RNA探針插入至膜片內部，同時注入微量工程核酸酶進行檢測；

S6，通過產生DNA雙鏈斷裂激活植物內源修復途徑,基因組編輯對靶位點的定點突變,缺失或者基因的插入與替換，實現檢測基因功能。

2.根據權利要求1所述的一種智能全基因組范圍的植物基因功能鑒定系統及方法，其特征在于，步驟S5中，利用工程核酸酶在靶位點產生雙鏈斷裂，通過同源重組或者非同源末端連接的自我修復途徑進行基因組修飾，應用工程核酸酶為，所述工程核酸酶包括鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活子內效應子核酸酶(TALEN)和規律成簇間隔短回文重復序列及其核酸酶(CRISPR/Cas9)，所述工程核酸酶包含DNA識別與結合結構域以及核酸內切酶切割結構域(對特定靶位點進行特異性的結合并切割產生DSB。

3.根據權利要求1所述的一種智能全基因組范圍的植物基因功能鑒定系統及方法，其特征在于，步驟S1中，保持濕度75％以上、溫度20～25℃、12h/12h光照和黑暗交替、光強1200～2400Lux。

4.根據權利要求1所述的一種智能全基因組范圍的植物基因功能鑒定系統及方法，其特征在于，步驟S6中，通過識別特異的DNA序列，激活靶基因的轉錄而引起植物病害，李勇TALE蛋白具有特異的結構，帶轉運信號的N端、帶核定位信號及轉錄激活結構域的C端以及具有DNA特異識別與結合能力的中部結構域，中部的DNA識別與結合結構域一般由不同數目的連續串聯重復單體構成，每個重復單體含有33-35個氨基酸堿基，兩個可變的氨基酸殘基稱為重復序列可變的雙氨基酸殘基,決定了TALE對DNA識別的特異性，每個重復單體的RVD識別不同的堿基，構成了TALE識別DNA的密碼，包括NI、HD、NG、NH、NN分別識別A、C、T、G、G/A，其中NH對G的識別特異性較NN強。

5.根據權利要求1所述的一種智能全基因組范圍的植物基因功能鑒定系統及方法，其特征在于，所述植物培養基包括吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、二氯苯氧乙酸(2，4-D)、玉米素、6-芐基嘌呤、激動素、鈣鹽、磷酸鹽和蔗糖構成的混合物。

6.根據權利要求1所述的一種智能全基因組范圍的植物基因功能鑒定系統及方法，其特征在于，步驟S4中，將待標記的RNA探針片斷變性后與隨機引物一起雜交，然后以此雜交的寡聚核苷酸為引物，在SP6RNA聚合酶和T7RNA聚合酶催化下，合成與探針RNA互補的RNA鏈，當在反應體系中含有a-32P-dNTP時，即形成檢測功能標記的RNA探針。