[發(fā)明專利]單加氧酶突變體及其應用

有效

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• 申請日: 2019-04-17
• 公開（公告）號: CN110055230B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發(fā)明（設計）人: 洪浩;詹姆斯·蓋吉;盧江平;張娜;馬玉磊;程逸冰;牟慧艷
• 申請（專利權）人: 凱萊英生命科學技術(天津)有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12P17/00
• 代理公司: 北京康信知識產(chǎn)權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 韓建偉

本發(fā)明公開了一種單加氧酶突變體及其應用。該單加氧酶突變體的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列發(fā)生突變得到的氨基酸序列，突變至少包括如下突變位點之一：第49位、第60位、第61位、第144位、第145位、第146位、第147位、第167位、第169位、第189位、第246位、第247位、第280位、第284位、第285位、第286位、第287位、第328位、第330位、第332位、第382位、第427位、第428位、第429位、第430位、第431位、第432位等，本發(fā)明的單加氧酶突變體具有立體選擇性大幅度提高的優(yōu)勢，并且酶活也有相應提高。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種單加氧酶突變體及其應用。

背景技術

傳統(tǒng)的化學氧化劑大多是有毒和/或易爆的，且立體選擇性很低，出于環(huán)境友好以及合成高光學純度藥物和農(nóng)用化學品的需要，人們正不斷開發(fā)新型氧化劑。環(huán)己酮單加氧酶(CHMO)是一種還原型輔酶I(NADPH)依賴型氧化酶，可催化酮、醛以及一些硫化物、硒化物的氧化反應。單加氧酶在有機合成中應用較廣，具有較好的選擇性、可控性和經(jīng)濟性。對于手性藥物的合成，通常產(chǎn)品構型不同，其功能、毒性相差很大，因此，得到高光學純度的手性化合物在制藥研發(fā)中非常重要。近幾十年來，單加氧酶一直作為生物催化劑被用于催化立體選擇性的反應中，進而合成一系列有價值的手性化合物[Protein Engineering ofStereoselective Baeyer—Villiger Monooxygenases].[J].Chemistry-A EuropeanJournal,2012,18(33)。

硫培南作為青霉烯類抗生素的一種，由美國Pfizer公司研發(fā)，為注射用青霉烯類抗生素，具有抗菌譜廣，抗菌活性強，不易被β-內(nèi)酰胺酶水解等特性[Antibacterialactivity of sulopenem,a new parenteral penem antibiotic].[J].Japanese Journalof Antibiotics,1996,49(4):338。在世界抗生素市場中，占有越來越重要的地位。

利用生物酶法進行不對稱合成，由于自身高選擇性以及環(huán)境友好性等優(yōu)勢，越來越受到人們的關注。(R)-3-羥基-四氫噻吩是生產(chǎn)抗生素硫培南等多種藥物的關鍵中間體，在酶催化合成硫培南側鏈的方法中(見下圖)，我們通過蛋白質改造，已經(jīng)獲得了選擇性和活性都大幅提高的酮還原酶突變體，可催化第一步3-酮基四氫噻吩轉化為(R)-3-羥基-四氫噻吩[專利：酮還原酶突變體及其應用(公開號CN108048417A)]。在第二步酶催化反應中，可采用單加氧酶取代化學法進行(R)-3-羥基-四氫噻吩的氧化反應，避免化學放熱反應，同時生成高光學純度的產(chǎn)品(R，R)-1-氧-3-羥基四氫噻吩。

然而對于目前來說，野生型的單加氧酶存在選擇性極低，活性較差等缺點，距離工業(yè)化應用有較大的差距。一般而言，我們可以通過蛋白質工程的手段對野生酶進行改造，提高酶的立體選擇性和活性，從而可以應用在工業(yè)生產(chǎn)中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種單加氧酶突變體及其應用，以解決現(xiàn)有技術中單加氧酶選擇性差、酶活性低的技術問題。