[發明專利]一種腸出血性大腸埃希菌O157:H7檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201910307905.6
• 申請日: 2019-04-17
• 公開（公告）號: CN109988852A
• 公開（公告）日: 2019-07-09
• 發明（設計）人: 周明旭;盧宇;徐悅;馬芳;鮑熹;尹文竹;張金秋;鄧碧華;呂芳
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產權代理有限公司 11467
• 代理人: 王斌

本發明提供一種腸出血性大腸埃希菌O157:H7檢測試劑盒，試劑盒包括兩組引物，第一組引物用于檢測O157:H7與O55:H7菌株獨有的lpf2C基因，上、下游引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；第二組引物用于排除O55:H7菌株，上、下游引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。本發明的試劑盒根據GenBank上大腸桿菌O157:H7獨有的保守序列設計，具有很高的特異性和敏感性，操作簡便。為臨床快速區分和鑒定大腸桿菌O157:H7菌株提供新的方法和選擇。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種腸出血性大腸埃希菌O157:H7檢測試劑盒，該試劑盒利用大腸埃希菌O157:H7和大腸埃希菌O55:H7菌株獨有的lpf2C基因型，以及兩種細菌中lpf2D基序的差異作為分子標記，利用該序列設計兩對特異性的引物，通過常規PCR擴增特征性基因片段進行檢測。

背景技術

埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli) 是革蘭氏染色陰性，呈桿狀的兼性厭氧菌，通常存在于溫血動物的胃腸道。其中，血清型O157:H7大腸桿菌是腸出血型大腸桿菌（enterohemorrhagic E. coli, EHEC）中最重要的一類，在世界范圍內引起人類和動物的爆發感染。該菌感染劑量低，侵入人體后，可以引起出血性或非出血性腹瀉、出血性結腸炎和溶血性尿毒綜合癥等，具有非常重要的公共衛生意義。為了及時、準確地監控可能發生的爆發感染，建立敏感、特異和可靠的技術用于快速而選擇性的檢測大腸桿菌O157:H7是極其必要的。

實驗室對大腸桿菌O157:H7的傳統鑒定方法基于選擇性培養基，該方法要求分離純化菌株，然后再選擇性培養基上劃線培養，全部流程耗時長，人力成本高，同時根據顯色反應造成的誤判結果也多，不利于對該類細菌的監控快速、準確的要求。近年來，由于分子生物學技術的發展，運用PCR 技術檢測大腸桿菌O157:H7的方法也有很多被建立，選擇志賀毒素stx1 和stx2、LEE毒力島eae、菌毛fimA、鞭毛fliC等基因中的一個或者多個作為分子標記。然而雖然鑒定該類基因可以在一定程度上幫助對O157:H7菌株的預警，但由于大多基因并不是O157:H7菌株所獨有，因此其結果也并非100%的可靠。

長極性菌毛（LPF）是大腸桿菌中廣泛存在的一類菌毛，根據其在細菌基因組的位置可以分為LPF1型和LPF2型，而對LPF操縱子的基序分析后，可以再將LPF1分為5個基因型，LPF2分為3個基因型。本研究團隊根據GenBank上已有的O157:H7全基因組數據分析顯示，全部O157:H7菌株包含獨有的LPF1-3和LPF2-2基因型菌毛的操縱子，說明該操縱子內基因可以作為候選分子標記。但是該兩種基因型的菌毛操縱子同時還存在于O157:H7菌株的祖源菌株O55:H7菌株中，并不能直接用于O157:H7菌株的判定。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供一種快速、簡便、特異性強、適合臨床使用的特異性PCR檢測試劑盒，用于快速鑒別大腸桿菌O157:H7菌株。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案為：提供一種腸出血性大腸埃希菌O157:H7檢測試劑盒，所述試劑盒包括兩組引物，第一組引物用于檢測O157:H7與O55:H7菌株獨有的lpf2C基因，上、下游引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；第二組引物用于排除O55:H7菌株，上、下游引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

優選的，所述試劑盒還包括PCR 預混液和DNA 聚合酶，其中預混液包括：10×PCR緩沖液、dNTPs、MgCl₂。