[發明專利]一種適用于豬流行性腹瀉病毒培養的仔豬腸道上皮細胞快速制備方法

在審

• 申請號: 201910307643.3
• 申請日: 2019-04-17
• 公開（公告）號: CN109943521A
• 公開（公告）日: 2019-06-28
• 發明（設計）人: 沈學懷;潘孝成;趙瑞宏;張丹俊;戴銀;胡曉苗;候宏艷;周學利;朱林
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 合肥金安專利事務所(普通合伙企業) 34114
• 代理人: 金惠貞

1.一種適用于豬流行性腹瀉病毒培養的仔豬腸道上皮細胞快速制備方法，其特征在于操作步驟如下：

（1）制備潔凈腸斷

取0日齡未吃初乳的新生仔豬小腸腸道50～60cm，將腸道剪成5～7cm的腸斷，去除腸系膜，在磷酸鹽緩沖液中將腸斷縱向剖開，反復清洗腸斷3～5遍，直至清洗液變成清亮，得到潔凈腸斷；

（2）制備接種細胞團

在DMEM/F12不完全培養基中，刮取腸斷內面的上皮組織，將刮取物用移液槍頭反復吹吸分散細胞團，離心收集細胞團，重復清洗3次，既得接種細胞團；

（3）細胞培養

調整接種細胞團密度為25cm²細胞瓶有150～200個細胞團塊，在DMEM/F12完全培養基中培養15～20天，得到生長成片細胞團；

（4）細胞純化

在生長成片細胞團中加入胰酶消化，用DMEM/F12完全培養基終止消化反應，用移液槍頭輕輕吹打細胞面，并吸除含成纖維細胞的細胞液；利用成纖維細胞與生長成片細胞胰酶消化時間差實現純化，得到生長狀態良好的仔豬腸道上皮細胞。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（1）中，所述新生仔豬為0日齡未吃初乳的新生仔豬。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（1）中，所述磷酸鹽緩沖液由下列物質：氯化鈉8g/L、氯化鉀0.4g/L、磷酸二氫鉀0.06g/L、十二水合磷酸氫二鈉0.08g/L、碳酸氫鈉0.35g/L、頭孢噻呋鈉1g/L、慶大霉素50mg/L和蒸餾水配制而成，pH值為7.2～7.4，經0.22uL濾膜過濾除菌。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（2）中，用2片玻璃載玻片的窄邊對腸道內面進行刮取細胞團，用1mL移液槍頭反復吹吸分散細胞團；轉速1000r/min條件下離心5min，收集細胞團，用DMEM/F12不完全培養基反復清洗細胞團3次。

5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（2）中，所述DMEM/F12不完全培養基由下列物質：DMEM/F12培養液500mL、100U/mL青霉素、0.1mg/mL鏈霉素、15ng/mL表皮生長因子和5mL 100倍濃度胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑配制而成。

6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（3）中，在DMEM/F12完全培養基中、溫度37℃、濃度5%的CO₂氣體的培養箱中，培養48h；更換細胞培養液，去除未貼壁細胞團；繼續培養15～20天；得到生長成片細胞團。

7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（3）或（4）中，DMEM/F12完全培養基由下列物質：DMEM/F12培養液500mL、25mL胎牛血清、100U/mL青霉素、0.1mg/mL鏈霉素、15ng/mL表皮生長因子和5mL 100倍濃度胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑配制而成。

8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（4）中，將25cm²細胞瓶中生長成片細胞團用3mL磷酸鹽緩沖液潤洗細胞貼壁面2次；在潤洗后的生長成片細胞團中加入1mL濃度為 0.1%胰酶消化液，37℃條件下消化；消化過程中注意觀察細胞形態，成纖維細胞消化1～2min變圓脫落，腸道上皮細胞在5～6min變圓脫落，在消化3min時，傾去消化液，加入DMEM/F12完全培養基2mL終止消化反應，用1mL移液槍頭輕輕吹打細胞面，吸除含雜細胞的細胞液，再加入DMEM/F12完全培養基5mL繼續培養，至此完成一次細胞純化；如仍有成纖維細胞，可重復進行上述細胞純化操作，直至得到生長狀態良好的仔豬腸道上皮細胞。

9.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：細胞培養用25cm²細胞瓶經濃度為10ug/cm² I型膠原包被，使用前用磷酸鹽緩沖液清洗細胞瓶2次。

10.利用權利要求1制得的仔豬腸道上皮細胞進行豬流行性腹瀉病毒培養的方法，其特征在于具體操作如下：

當純化的仔豬腸道上皮細胞在25cm²細胞瓶內的鋪壁率為80～90%時，用磷酸鹽緩沖液潤洗2次，加入豬流行性腹瀉病毒液1mL和濃度0.1%的胰酶消化液10uL，孵育2～3h；孵育期間每隔10分鐘搖晃細胞瓶，使病毒液均勻鋪于細胞貼壁面，孵育結束吸出孵育液，加入6mL不完全DMEM/F12培養基和0.1%的胰酶消化液60uL繼續培養3～4天，或出現明顯的細胞病變，將細胞瓶取出，將細胞液和細胞進行反復凍融2次后收集豬流行性腹瀉病毒液。