[發明專利]蘇云金芽胞桿菌殺蟲基因cry79Aa1、表達蛋白及其應用

有效

• 申請號: 201910306777.3
• 申請日: 2019-04-17
• 公開（公告）號: CN109929015B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 李海濤;劉榮梅;高繼國;張杰
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C07K14/325
• 分類號: C07K14/325;C12N15/32;C12N15/70;C12N15/82;C12N1/21;A01H5/00;A01H6/00;A01N47/44;A01P7/04
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

本發明涉及蘇云金芽胞桿菌殺蟲基因cry79Aa1、表達蛋白及其應用，屬于生物防治技術領域。從蘇云金芽胞桿菌LTS290(其保藏編號為：CGMCC No.10232)分離得到的殺蟲蛋白Cry79Aa，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，及編碼該殺蟲蛋白的基因，優選所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。上述基因對鱗翅目害蟲具有一定的毒殺力，以應用于轉化微生物和植物，使之表現出對相關害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物的抗藥性產生。

技術領域

本發明涉及生物防治技術領域，特別是本發明涉及對鱗翅目農業害蟲具有高毒力的Bt殺蟲基因及由該基因所編碼的蛋白質。

背景技術

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏陽性細菌，是一種對害蟲毒力強且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動物和人無毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個目3000多種害蟲有活性。Bt在芽胞形成期可形成殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)，也稱δ-內毒素 (delta-endotoxin)，它的形狀、結構和大小均與其毒力有著密切關系[Schnepf.E,Crickmore. N,Van Rie.J.,Lereclus.D,Baum.J,Feitelson.J,Zeigler.D.R.,Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev,1998, 62(3):775-806.]。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一個ICPs基因，并于1985年發表了它的DNA堿基序列及其編碼蛋白的氨基酸序列起，目前(2019年4月)cry模式基因312個，cyt 模式基因11個。當今，采用噴施化學農藥防治手段固然可以減輕害蟲對農作物的為害，但化學農藥造成環境污染，長期以來，大量噴施化學殺蟲劑，不僅會增強害蟲的抗藥性，使益蟲及其它生態區系遭受破壞，而且嚴重污染環境，提高生產成本，破壞生態平衡。蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白因其殺蟲效果好、安全、高效等優點而被廣泛的應用于蟲害防治。蘇云金芽胞桿菌除了直接作為生物農藥以外，1996年全世界第一例轉基因抗蟲植物在美國獲準應用，它使用的基因來自Bt cry1Ac。在接下來的幾年里，轉cry1Ab基因的抗蟲玉米，轉cry3Aa 基因的抗蟲土豆等相距問世。在中國，自1998年開始正式推廣含有cry1Ac/cry1Ab基因的抗蟲棉以來，已經被普遍種植。在轉基因作物商業化的第一個12年(1996-2007)中，由于能得到持續穩定的收益，農民種植轉基因作物量逐年增加。2017年，27個國家的1800萬農民種植了1.89億公頃的轉基因作物，轉基因作物商業化給工業化國家和發展中國家的農民都帶來了經濟和環境效益。蘇云金芽胞桿菌及其基因發掘已成為可持續發展農業中重要課題。

由于目前商品化的轉基因抗蟲作物的抗蟲基因種類比較單一，如此大面積推廣種植存在害蟲避難所減少與害蟲抗藥性上升的風險。因此需要不斷分離高毒力的或者新的基因組合來避免害蟲抗藥性上升的風險。因此，篩選分離克隆新的、高毒力的Bt殺蟲基因，可以豐富殺蟲基因資源，為轉基因作物與工程菌株提供新的基因來源，提高Bt轉基因產品的抗蟲效果，并且可以降低害蟲對Bt毒蛋白的抗性風險，避免新的生態災難降臨，具有重要的經濟、社會和生態效益。

發明內容

本發明從黑龍江省五常市拉林鎮附近土壤中分離得到蘇云金芽胞桿菌菌株LTS290，對鱗翅目害蟲小菜蛾，甜菜夜蛾，棉鈴蟲等有殺蟲活性，從該菌株中克隆得到新基因cry79Aa1和其晶體殺蟲蛋白，以應用于轉化微生物和植物，使之表現出對相關害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物的抗藥性產生。

蘇云金芽胞桿菌殺蟲蛋白Cry79Aa1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

殺蟲基因cry79Aa1，編碼殺蟲蛋白Cry79Aa1。

殺蟲基因cry79Aa1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。