[發明專利]用于乙肝病毒感染的重組巨細胞病毒與應用

有效

• 申請號: 201910306571.0
• 申請日: 2019-04-17
• 公開（公告）號: CN110055228B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 劉嘉;黃紅明;米爾科·特里林;楊東亮
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/86;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

本發明提供了用于乙肝病毒感染的重組巨細胞病毒，所述重組巨細胞病毒能表達乙型肝炎病毒表面抗原，所述重組巨細胞病毒通過細菌人工染色體誘變產生，所述乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示。該重組巨細胞病毒可表達HBV表面抗原的完整復制及缺陷型復制；在HBV小鼠復制模型中證實了表達HBV表面抗原的重組巨細胞病毒載體乙肝疫苗抗HBV的免疫功效；初步闡明了表達HBV表面抗原的重組巨細胞病毒載體乙肝疫苗抗HBV的免疫功效的免疫機制。為尋找治愈乙肝的治療性藥物提供了新的理論與實踐基礎，在臨床應用上有重要意義。

技術領域

本發明涉及病毒學、免疫學和醫學技術領域，特別涉及預防和治療乙肝病毒感染的重組巨細胞病毒與應用。

背景技術

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性的公共衛生問題，慢性HBV感染在我國尤為嚴重。雖然全球范圍內推廣實行嬰兒和新生兒接種HBV預防性疫苗后已經大大減少了新發感染病例,但是慢性感染人群依然無法得到徹底治療。預防性疫苗是控制HBV發病不可或缺的一部分，但是我們更需要新的藥物或者治療性疫苗治愈已經感染HBV的人群以減少HBV及其相關疾病所引起的死亡。

急性自限性HBV感染的患者體內會自發出現針對HBV核心(即核衣殼)、聚合酶和表面(即包膜)蛋白的多克隆和多特異性輔助性T細胞以及細胞毒性的T細胞應答，而這些細胞應答在慢性HBV感染患者中出現功能障礙，反應很弱甚至檢測不到。所以針對慢性HBV新的治療性藥物或者疫苗應該與特異性免疫應答特別是T細胞反應相結合，才能有效地治愈HBV。CMV作為載體的疫苗在聯合特異性T細胞反應方面具有強大潛能，能夠大幅度增強CD8+T細胞的免疫優勢，可能實現在個體中建立保護性CD8+T細胞應答的目標。而HBV感染后特異性免疫激活與否決定著感染的最終結局，當機體免疫系統未能及時控制HBV感染時就會進展為慢性感染，此時CD8+T細胞存在功能耗竭，病毒特異性CD8+T細胞功能耗竭是HBV病毒持續復制的關鍵因素之一。

細菌人工染色體(Bacterial?Artificial?Chromsomes，BAC)，是一種基因誘變工具，具有轉座效率高、負載容量大、宿主特異性差等特點。BAC用于維持和修飾大腸桿菌中不同來源的大序列。除基于RecA的穿梭誘變外，Red重組通常用于序列修飾。由于外源序列，如抗生素抗性基因以及frt-或loxP-位點在突變體BAC克隆中通常是不需要的，現有的一種技術允許無斑點生成點突變、缺失和插入較小的和更大的序列。該方法采用序列復制，其在第一次重組步驟中插入靶序列，并通過體內I-SceI切割和第二次Red重組切除選擇標記。為了在不使用額外質粒的情況下進行方便和高效的誘變，產生了具有染色體編碼的可誘導的Red-和I-SceI-表達的大腸桿菌菌株。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種用于乙肝病毒感染的重組巨細胞病毒。

用于乙肝病毒感染的重組巨細胞病毒，所述重組巨細胞病毒能表達乙型肝炎病毒表面抗原，所述重組巨細胞病毒通過細菌人工染色體誘變產生，所述乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示。

進一步地，所述細菌人工染色體誘變將在啟動子的控制下的乙型肝炎病毒表面抗原基因替換為巨細胞病毒中的m157或m27基因座。

進一步地，所述啟動子為真核EF1啟動子。

本發明還有另一個目的在于提供上述制備預防乙肝病毒感染的疫苗中的應用。

本發明的還有一個目的在于提供上述重組巨細胞病毒在制備治療慢性乙肝病毒感染的疫苗中的應用。

本發明的有益效果在于：構建了可表達HBV表面抗原的完整復制及復制缺陷型小鼠巨細胞病毒載體乙肝疫苗；并在HBV小鼠復制模型中證實了表達HBV表面抗原的重組巨細胞病毒載體乙肝疫苗打破慢性HBV耐受、抗HBV復制的免疫功效；初步闡明了表達HBV表面抗原的重組巨細胞病毒載體乙肝疫苗抗HBV的免疫功效的免疫機制。該發現為尋找治愈乙肝的治療性藥物提供了新的理論與實踐基礎，在臨床應用上有重要意義。