[發(fā)明專(zhuān)利]一種大麻素類(lèi)活性物質(zhì)的通用檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910306031.2
• 申請(qǐng)日: 2019-04-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110004179B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范春雷;程向榮
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江諾迦生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/867
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/867;C12N15/12;C07K14/705;G01N21/64
• 代理公司: 杭州浙科專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 周紅芳

1.一種大麻素類(lèi)活性物質(zhì)的通用檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：

1）將大麻素受體基因CB1克隆到一個(gè)含有EF1啟動(dòng)表達(dá)熒光蛋白的載體的CMV啟動(dòng)子下，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒；所述大麻素受體基因CB1為人源大麻素受體CB1基因，熒光蛋白為copGFP；

2）將步驟1）構(gòu)建的帶熒光蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到真核永生化細(xì)胞，并建立EF1-熒光蛋白基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增得到檢測(cè)組培養(yǎng)液；同樣建立轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒，建立空白對(duì)照EF1-熒光蛋白基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增得到對(duì)照組培養(yǎng)液；所述空白對(duì)照質(zhì)粒為pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP質(zhì)粒，建立空白對(duì)照EF1-熒光蛋白基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的過(guò)程為：將pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP質(zhì)粒、pH1質(zhì)粒、pH2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至慢病毒包裝細(xì)胞293V，制備得到EF1-copGFP慢病毒，將EF1-copGFP慢病毒感染人胚腎細(xì)胞293，得到空白對(duì)照單克隆細(xì)胞系copGFP/293；

3）步驟2）檢測(cè)組培養(yǎng)液中加入四氫大麻酚，配制一系列不同四氫大麻酚濃度的檢測(cè)組標(biāo)準(zhǔn)液；檢測(cè)組標(biāo)準(zhǔn)液中分別加入細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子探針試劑，充分反應(yīng)后，進(jìn)行檢測(cè)胞內(nèi)熒光蛋白的熒光值PF和熒光鈣離子的熒光值Ca²⁺F，以測(cè)得的熒光值Ca²⁺F/熒光值PF比值作為縱坐標(biāo)，以四氫大麻酚的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算擬合回歸方程；

4）步驟2）檢測(cè)組培養(yǎng)液和對(duì)照組培養(yǎng)液中分別加入待測(cè)樣本，分別配制得到樣本液和對(duì)照液，樣本液中的待測(cè)樣本濃度與對(duì)照液中的待測(cè)樣本濃度相同；樣本液和對(duì)照液中分別加入細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子探針試劑，充分反應(yīng)后，對(duì)反應(yīng)后的樣本液進(jìn)行檢測(cè)胞內(nèi)熒光蛋白的熒光值PF₁和熒光鈣離子的熒光值Ca²⁺F₁，對(duì)反應(yīng)后的對(duì)照液進(jìn)行檢測(cè)胞內(nèi)熒光蛋白的熒光值PF₂和熒光鈣離子的熒光值Ca²⁺F₂，計(jì)算得到熒光值Ca²⁺F₁/熒光值PF₁比值與熒光值Ca²⁺F₂/熒光值PF₂比值之差，并代入步驟3）回歸方程，即可計(jì)算出檢測(cè)樣本中的大麻素類(lèi)活性物質(zhì)含量；

步驟1）構(gòu)建的質(zhì)粒為pCMV-CB1·EF1-copGFP質(zhì)粒，其制備過(guò)程為：將人源大麻素受體CB1基因克隆到慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的CMV啟動(dòng)子下，連接酶切位點(diǎn)為EcoR?I和Not?I，構(gòu)建真核表達(dá)所述pCMV-CB1·EF1-copGFP質(zhì)粒；

步驟2）中，所述真核永生化細(xì)胞為慢病毒包裝細(xì)胞293V，建立EF1-熒光蛋白基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的過(guò)程為：將pCMV-CB1·EF1-copGFP質(zhì)粒、pH1質(zhì)粒、pH2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至慢病毒包裝細(xì)胞293V，制備得到CMV-CB1·EF1-copGFP慢病毒，將CMV-CB1·EF1-copGFP慢病毒感染人胚腎細(xì)胞293；并在熒光顯微鏡下通過(guò)挑取克隆的方法獲得穩(wěn)定表達(dá)人源大麻素受體CB1的單克隆細(xì)胞系CB1·copGFP/293；

步驟3）和步驟4）中的細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子探針試劑均為Fura?Red。

2.如權(quán)利要求1所述的一種大麻素類(lèi)活性物質(zhì)的通用檢測(cè)方法，其特征在于步驟3）中，向檢測(cè)組培養(yǎng)液加入四氫大麻酚，配制四氫大麻酚濃度分別為0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL和1.6ng/mL的5種檢測(cè)組標(biāo)準(zhǔn)液。

3.如權(quán)利要求1所述的一種大麻素類(lèi)活性物質(zhì)的通用檢測(cè)方法，其特征在于步驟3）中，進(jìn)行檢測(cè)胞內(nèi)熒光蛋白的熒光值PF和熒光鈣離子的熒光值Ca²⁺F的方法為：用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)試，選擇482nm單波長(zhǎng)激發(fā)，以507nm和640nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)，其中507nm波長(zhǎng)下檢測(cè)胞內(nèi)熒光蛋白的熒光值PF，640nm波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光鈣離子的熒光值Ca²⁺F。