[發(fā)明專利]一種CAR-T細(xì)胞的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910303075.X
• 申請日: 2019-04-16
• 公開（公告）號(hào): CN109868260A
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李軍輝
• 申請（專利權(quán)）人: 上海漢尼生物細(xì)胞技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10
• 代理公司: 上海灣谷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31289
• 代理人: 李曉星

本發(fā)明公開了一種CAR?T細(xì)胞的制備方法，其包括：采集供者的外周血單個(gè)核細(xì)胞；分選出CD3+T淋巴細(xì)胞，并進(jìn)行激活培養(yǎng)；將帶有目的基因的慢病毒載體感染激活的T淋巴細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染時(shí)添加了一定比例的DMSO；轉(zhuǎn)染后換液，并繼續(xù)對轉(zhuǎn)染后的T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得CAR?T細(xì)胞終產(chǎn)品。本發(fā)明在病毒載體轉(zhuǎn)染步驟中，添加適量的DMSO，顯著地降低了病毒轉(zhuǎn)染所需的MOI，從而降低病毒的用量，提高了CAR?T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，大大降低了制備成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種CAR-T細(xì)胞的制備方法。

背景技術(shù)

CAR-T技術(shù)，即Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。目前在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治療上有著顯著的療效，被認(rèn)為是最有前景的腫瘤治療方式之一。

CART細(xì)胞制備的一般過程，包括從富含免疫細(xì)胞的血樣采集，T細(xì)胞的分選與激活，T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，T細(xì)胞的擴(kuò)增，最終制劑的制備。其中，將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染過程，大多采用慢病毒(Lentivirus)感染的方式。由于慢病毒性狀的特點(diǎn)，穩(wěn)定、可靠、大量的慢病毒制備現(xiàn)在是CAR-T細(xì)胞制備領(lǐng)域的一項(xiàng)瓶頸。

如何能顯著降低T細(xì)胞制備病毒轉(zhuǎn)染過程中病毒的用量，從而提升制備效率、顯著降低CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)成本，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的，就是為了解決上述問題而提供了一種CAR-T細(xì)胞的制備方法，通過降低感染時(shí)的MOI(multiplicity of infection，感染復(fù)數(shù))方式，大大降低病毒載體的用量，由此顯著提升T細(xì)胞感染后的CAR的表達(dá)比例。大大降低了CAR-T細(xì)胞制備過程中，病毒載體制備的壓力，節(jié)省了制備成本。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明的一種CAR-T細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

1)采集供者的外周血單個(gè)核細(xì)胞；

2)從步驟1)采集的外周血單個(gè)核細(xì)胞中分選出CD3+T淋巴細(xì)胞；

3)對分選得到的CD3+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行激活培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，CO₂濃度為5％；

4)將帶有目的基因的慢病毒載體感染經(jīng)過步驟3)激活培養(yǎng)后的T淋巴細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)的培養(yǎng)溫度為37℃，CO₂濃度為5％，且轉(zhuǎn)染時(shí)在培養(yǎng)基中按照每100ml培養(yǎng)基添加0.1-5ml的比例添加DMSO；

5)對經(jīng)步驟4)轉(zhuǎn)染后的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，CO₂濃度為5％，獲得CAR-T細(xì)胞終產(chǎn)品。

上述的一種CAR-T細(xì)胞的制備方法，其中，步驟2)中分選后的CD3+T淋巴細(xì)胞含量需達(dá)到5.0-10×10⁶/kg以上。

上述的一種CAR-T細(xì)胞的制備方法，其中，步驟3)中T淋巴細(xì)胞激活培養(yǎng)24-36小時(shí)后進(jìn)行所述步驟4)。

上述的一種CAR-T細(xì)胞的制備方法，其中，步驟4)轉(zhuǎn)染時(shí)，T淋巴細(xì)胞的密度控制在10-100萬細(xì)胞/ml。

上述的一種CAR-T細(xì)胞的制備方法，其中，步驟4)病毒感染的時(shí)間為18-36小時(shí)。

上述的一種CAR-T細(xì)胞的制備方法，其中，步驟5)所述回輸要求為T細(xì)胞比例不低于60％，CAR-T細(xì)胞比例不低于2％。

本發(fā)明在CAR-T細(xì)胞制備過程中，將目的CAR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到T細(xì)胞時(shí)，在轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)基中添加一定量的DMSO，通過降低感染時(shí)的MOI方式，大大降低病毒載體的用量。