[發(fā)明專利]水蛭素突變體的提取純化方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910301614.6
• 申請日: 2019-04-16
• 公開（公告）號: CN109957008B
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳杰鵬;段麗麗;陳鴻銳;胡留松;陳煜藩;洪琳;許志鍇;葉紅林;紀(jì)燁瑜;蔡春麗
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東雙駿生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/815
• 分類號: C07K14/815;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16;C12P21/02;A61J1/05;A61J1/14;C12R1/19
• 代理公司: 北京安信方達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11262
• 代理人: 凌翠;張奎燕

本申請公開了一種從大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)水蛭素突變體HV2?Lys47的發(fā)酵液中提取純化水蛭素突變體HV2?Lys47的方法，所述方法采用膜技術(shù)及一次柱層析技術(shù)，從而獲得高純度的水蛭素突變體HV2?Lys47。本申請還公開了由此制備的水蛭素突變體HV2?Lys47在抗凝采血管中的應(yīng)用及包含水蛭素突變體HV2?Lys47的抗凝采血管。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請涉及生物工程技術(shù)，尤指從大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)水蛭素突變體HV2-Lys47(SEQ ID NO.:1)的發(fā)酵液中提取純化水蛭素突變體HV2-Lys47的方法，及由此得到的純化的水蛭素突變體HV2-Lys47。

本申請還涉及生物醫(yī)療器械，尤指由上述方法純化制得的水蛭素突變體HV2-Lys47在抗凝采血管中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

天然水蛭素(Hirudin)是水蛭(Leech)及其唾液腺中已提取出的多種活性成分中活性最顯著并且研究得最多的一種成分，它是由65-66個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)(多肽)。水蛭含有豐富的水蛭素，水蛭素對凝血酶有極強(qiáng)的抑制作用，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凝血酶天然特異抑制劑。它可用于治療各種血栓疾病，尤其是靜脈血栓和彌漫性血管凝血的治療；也可用于外科手術(shù)后預(yù)防動脈血栓的形成，預(yù)防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善體外血液循環(huán)和血液透析過程。在顯微外科手術(shù)中常因?yàn)槲呛咸幯芩ㄈ鴮?dǎo)致失敗，采用水蛭素可促進(jìn)傷口愈合。研究還表明，水蛭素在腫瘤治療中也能發(fā)揮作用。它能阻止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，已證明有療效的腫瘤如纖維肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤和白血病等。水蛭素還可配合化學(xué)治療和放射治療，歸因于可促進(jìn)腫瘤中的血流而使療效增強(qiáng)。

由于天然水蛭素產(chǎn)能較低，臨床應(yīng)該量大，國內(nèi)外開展了大量重組水蛭素研究，自上個世紀(jì)八十年代末研制出與天然水蛭素結(jié)構(gòu)相似、作用相同的重組水蛭素，產(chǎn)能大。

然而，現(xiàn)有蛋白和肽類的純化基本都需要兩種或三種以上的多次層析分離才能拿到純品，并且洗脫劑包含大量的水和鹽，對環(huán)境污染大，污水處理工程壓力大。

目前市場所用的水蛭素突變體的抗凝活性為16000ATU/mg，純度為93％左右。

比如，陳華友等(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009年，37(34)；第16757-16759頁及第16768頁)公開了發(fā)酵液經(jīng)離心、三氯乙酸處理、超濾濃縮脫鹽，再上陰離子交換柱，S100分子篩柱，最后得到95％的純品；韋利軍等人(2004年全國生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文集，第104-112頁)公開了使用大孔樹脂層析、DEAE層析、反相色譜層析的三次層析法分離得到95％純品。其中，層析步驟越多，成本越高且越費(fèi)時，環(huán)境污染也越高。

因此，存在對工藝簡潔、廢水少、適合工業(yè)放大的水蛭素突變體HV2-Lys47的提取純化方法的需求。

此外，血液標(biāo)本的采集和分離在臨床生化檢測中至關(guān)重要，是保證質(zhì)量的一個重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的標(biāo)本采集從開始采血到血清析出上機(jī)檢測，往往需要較長時間，使全自動生化分析儀的高效性受到限制。部分生化實(shí)驗(yàn)室使用肝素抗凝血漿，取血后可以立即離心分離出血漿上機(jī)檢測，但無論肝素鈉還是肝素鋰抗凝血漿，對某些生化指標(biāo)都會產(chǎn)生影響。

1997年我國開始推廣真空采血技術(shù)，是對傳統(tǒng)采血方式的一次重大改進(jìn)。由于是在全封閉系統(tǒng)下完成采血程序，因而從根本上排除了血液污染和交叉感染的可能性，采血更安全、更準(zhǔn)確、更規(guī)范，因而易于普及和推廣。在真空采血管內(nèi)可加入分離膠、促凝劑，以及各種抗凝劑，以管帽的顏色來區(qū)分不同用途的采血管。

近年來，含促凝劑和分離膠的真空采血管在生化檢驗(yàn)被廣泛使用，它大大縮短了血液凝固的時間，一般放置20min后就可進(jìn)行離心分離出血清，但有一定比例的采血管離心效果不佳，血清中存在蛋白凝絲或凝塊。分離膠是一種由數(shù)種化合物組成的半固體惰性膠，不影響血清各成份的含量，但促凝管因促凝劑的原料產(chǎn)地、性質(zhì)、制作工藝不同，可能對生化檢測造成不同的影響。