[發(fā)明專利]過表達(dá)碳分解代謝物阻遏效應(yīng)轉(zhuǎn)錄抑制因子基因的工程菌及其構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910301370.1
• 申請日: 2019-04-15
• 公開（公告）號: CN110029081B
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何寧;王玲偉
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P19/04;C12R1/10
• 代理公司: 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

1.一株過表達(dá)碳分解代謝物阻遏效應(yīng)轉(zhuǎn)錄抑制因子基因ccpN的地衣芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于所述碳分解代謝物阻遏效應(yīng)轉(zhuǎn)錄抑制因子基因ccpN的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示；

利用PCR擴(kuò)增克隆碳分解代謝物阻遏效應(yīng)轉(zhuǎn)錄抑制因子基因ccpN，將基因ccpN片段連接到表達(dá)載體上，然后利用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）中，通過四環(huán)素抗性篩選獲得含目的基因的工程菌；

所述表達(dá)載體的啟動子為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) α-淀粉酶基因的啟動子PamyL；所述地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)已于2009年01月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo.2876。

2.如權(quán)利要求1所述一株過表達(dá)碳分解代謝物阻遏效應(yīng)轉(zhuǎn)錄抑制因子基因ccpN的地衣芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于所述表達(dá)載體為游離載體。

3.如權(quán)利要求1所述一株過表達(dá)碳分解代謝物阻遏效應(yīng)轉(zhuǎn)錄抑制因子基因ccpN的地衣芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于所述表達(dá)載體為表達(dá)載體PHY300PLK-PamyL-TTamyL。

4.如權(quán)利要求1所述過表達(dá)碳分解代謝物阻遏效應(yīng)轉(zhuǎn)錄抑制因子基因ccpN的地衣芽孢桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟：

1）設(shè)計(jì)碳分解代謝物阻遏效應(yīng)轉(zhuǎn)錄抑制因子基因ccpN的PCR引物；

2）將擴(kuò)增得到的目的基因插入到PHY300PLK-PamyL-TTamyL組成型啟動子PamyL下游多克隆位點(diǎn)，得到PHY300－ccpN過表達(dá)質(zhì)粒；

3）將PHY300－ccpN過表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到E.coli DH5α中擴(kuò)增；

4）將經(jīng)提取、濃縮后的PHY300－ccpN過表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌，37℃復(fù)蘇5 h，于四環(huán)素抗性LB固體培養(yǎng)基上涂布，在37℃培養(yǎng)12h，篩選轉(zhuǎn)化子；

5）轉(zhuǎn)化子經(jīng)質(zhì)粒提取后，通過菌落PCR和雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證，獲得過表達(dá)碳分解代謝物阻遏效應(yīng)轉(zhuǎn)錄抑制因子基因的地衣芽孢桿菌重組菌HN301-6。

5.如權(quán)利要求1所述過表達(dá)碳分解代謝物阻遏效應(yīng)轉(zhuǎn)錄抑制因子基因ccpN的地衣芽孢桿菌基因工程菌在制備多糖絮凝劑中應(yīng)用。

6.如權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于所述過表達(dá)碳分解代謝物阻遏效應(yīng)轉(zhuǎn)錄抑制因子基因ccpN的地衣芽孢桿菌基因工程菌在制備多糖絮凝劑中應(yīng)用的具體步驟如下：

1）使用接種環(huán)于四環(huán)素抗性培養(yǎng)基上取一環(huán)地衣芽孢桿菌重組菌HN301-6單菌落接種于液體種子培養(yǎng)基中，35～37℃，200r/min培養(yǎng)12～16h，制備種子培養(yǎng)液；

2）以體積百分比為4％的接種量接種于多糖絮凝劑發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30～40℃，150～300r/min條件下培養(yǎng)50～60h，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)多糖絮凝劑實(shí)驗(yàn)；

3）將多糖絮凝劑發(fā)酵后所得發(fā)酵液離心收集上清液，將上清液用乙醇沉淀法沉淀溶解于水后冷凍真空干燥即得。

7.如權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于在步驟3）中，所述乙醇沉淀法的具體步驟為用三倍體積的乙醇提取，4℃靜置12h，離心的速度為6000rpm，離心時間為15min，離心溫度為4℃。