[發明專利]一種同步檢測TMV、CMV和PVY的三重實時熒光定量RT-qPCR方法

在審

• 申請號: 201910294310.1
• 申請日: 2019-04-12
• 公開（公告）號: CN110066888A
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發明（設計）人: 阮小蕾;林壁潤;鄧海濱;沈會芳;陳澤鵬;王曉賓
• 申請（專利權）人: 華南農業大學;廣東省農業科學院植物保護研究所;廣東省煙草南雄科學研究所;中國煙草總公司廣東省公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳嘉毅

本發明公開了一種同步檢測TMV、CMV和PVY的三重實時熒光定量RT?qPCR方法。本發明以TMV、CMV和PVY的外殼蛋白保守序列為靶標序列設計得到一組三重實時熒光定量RT?qPCR引物組合，包括引物組qTMV?F/qTMV?R、引物組qCMV?F/qCMV?R、以及引物組qPVY?F/qPVY?R；其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～6所示。并進一步以該引物組為基礎，首次建立了三重實時熒光定量RT?qPCR方法，能夠快速、準確、高效地鑒定和檢測TMV、CMV和PVY，檢測靈敏度顯著高于ELISA和RT?PCR這兩種方法。另外，該方法操作簡單、檢測靈敏度高、特異性強、穩定性好，易于基層檢測單位推廣使用，具有廣闊的發展空間和良好的實際應用價值。

技術領域

本發明屬于植物病毒檢測技術領域，更具體地，涉及一種同步檢測TMV、CMV和PVY的三重實時熒光定量RT-qPCR方法。

背景技術

煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)和馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是侵染煙草的三種主要病毒。它們引發的病毒病煙株在田間發生病毒病的原因主要有土壤帶毒傳毒、昆蟲傳毒、苗期帶毒等，其中，煙田土壤帶毒傳毒是煙草病毒病傳播的主要途徑之一。造成TMV、CMV和PVY土壤非介體傳播的原因主要是TMV、CMV和PVY在煙草病根中的存活期比較長，而且它們極易通過根系的傷口侵入煙株，田間移苗時會使根系產生許多微傷口，土壤病殘體中的病毒便會趁機侵入煙苗根部。近年來，煙草病毒病的發生呈上升趨勢，嚴重影響煙葉的品質和產量，導致煙草產業經濟損失巨大，使煙農收入減少，降低其種植煙草的積極性。快速、準確地檢測煙草上的相關病毒是生產上防控病害、減少損失的重要手段之一。

病毒的常規檢測方法有電鏡檢測、酶聯免疫吸附測定(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay，ELISA)和聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)(如果檢測對象是RNA病毒，則為RT-PCR)技術。ELISA操作簡便，成本低廉。但是，ELISA檢測結果底物溶液的顯色反應存在非特異性顏色反應的干擾，可能出現假陽性現象，從而影響該方法的準確性和靈敏度。RT-PCR具有省時、經濟、高效等優點。與ELISA相比，它具有更高的靈敏度和更快的檢測速度，可以節約大量時間。但是在設置RT-PCR反應程序時要注意退火溫度的選擇，不合適的退火溫度可能引起非特異性擴增或者沒有條帶，從而影響實驗結果的判斷。因此，亟需建立一種針對土壤攜帶病毒的簡單、快速、靈敏度高、特異性強、穩定性好的檢測方法。

前人對煙田土壤中病原物檢測的研究、報道較少。周雪平等用指示指物法和ELISA法檢測了土壤中的CMV，證明了CMV可以通過土壤進行非介體傳播。劉敏等比較分析了病毒生物學測定、DAS-ELISA、膠體金試紙條檢測和RT-PCR等4種方法檢測土壤中TMV的靈敏度及特異性。任錫毅等結合實時熒光RT-PCR和試管捕捉RT-PCR法，對實時熒光RT-PCR法加以改進，并在此基礎上成功構建了能同時檢測TMV和PVY的多重試管捕捉實時熒光RT-PCR檢測體系。孫潔等用實時熒光定量PCR建立了檢測香蕉中CMV的方法。

TMV、CMV和PVY這三種病毒可嚴重侵染煙草造成煙草病毒病，影響煙草的產量和品質，但目前國內外還未見有通過實時熒光定量RT-qPCR法定性和定量同時檢測TMV、CMV和PVY這三種病毒的報道。因此，為避免更大的經濟損失，亟需一種能夠同時快速、高效、準確鑒定和檢測TMV、CMV和PVY的分子生物學方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服上述現有技術的缺陷和不足，提供一種同步檢測TMV、CMV和PVY的三重實時熒光定量RT-qPCR方法。本發明主要的創新點在于針對煙草上的TMV、CMV和PVY，開發一種能夠快速、高效、準確鑒定和檢測上述三種病毒的三重實時熒光定量RT-qPCR方法，以利于在基層檢測單位中推廣使用。