[發明專利]一種評價松樹愈傷組織對松材線蟲抗性的方法

在審

• 申請號: 201910292853.X
• 申請日: 2019-04-11
• 公開（公告）號: CN109924129A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 朱麗華;夏馨蕊;沈李元;方天雨;楊帆;葉建仁;吳小芹
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

本發明公開了一種評價松樹愈傷組織對松材線蟲抗性的方法，其特征在于，利用無菌松材線蟲對所誘導的松樹胚性細胞系進行接種，通過愈傷組織外觀形態變化、TTC細胞化學染色結果、線蟲種群增長速率，比較不同細胞系對松材線蟲的響應，從而篩選出抗性細胞系，淘汰敏感細胞系，實現在愈傷組織階段就對松樹胚性細胞的抗松材線蟲特性進行早期評價。本發明利用無菌松材線蟲對所誘導的松樹胚性細胞系進行接種，通過愈傷組織外觀形態變化、TTC細胞化學染色結果、線蟲種群增長速率，比較不同細胞系對松材線蟲的響應，從而篩選出抗性細胞系，淘汰敏感細胞系，在愈傷組織階段就對其抗松材線蟲特性進行早期評價，是一種簡便、快速的愈傷組織抗松材線蟲特性評價方法。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種評價松樹愈傷組織對松材線蟲抗性的方法。

背景技術

松材線蟲病是松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)引起的毀滅性重大森林病害，是我國建國以來發生最嚴重和最危險的重大傳染性森林病害，也是國際國內重大的森林植物檢疫對象。目前主要分布在美國、加拿大、日本、中國、韓國、葡萄牙和西班牙等國家(Mota et al.，1999；Abelleira et al.，2011)。我國于1982年首次發現松材線蟲病，三十多年來，該病害迅速擴散到南方多個省(區)，并逐步向北方省份蔓延。2018年全國共有18個省588個縣級行政區發生松材線蟲病疫情。該病害不僅危害松屬樹種，也危害落葉松屬樹種(于海英，2018)，對我國9億畝松林資源造成嚴重威脅，對生態系統造成了極大破壞，生產上迄今尚無經濟可行的化學、物理或生物防治手段對其進行有效控制。

抗病育種是病害防治的重要途徑之一。針對松材線蟲病，國內外均開展了抗病選育工作并取得了顯著成效，建立了抗病基因庫和種子園。然而抗病種子生產周期長、產量有限，且可能性狀分離而不能保持親本優良性狀，因此優良抗病材料如何規?；瘧糜谏a已成為松樹抗病育種事業發展中的瓶頸。

植物組織培養技術，尤其是體細胞胚胎發生植株再生技術，具有繁殖速度快，可全年連續生產等優點，已成為良種繁育的重要捷徑。體細胞胚胎發生植株再生途徑是雙或單倍體的體細胞在特定條件下未經細胞融合而通過與合子胚胎發生類似的途徑發育形成像受精卵那樣的體細胞胚胎，在適宜條件下成熟并“萌發”成完整植株的結構，通常包含胚性愈傷組織的誘導、胚性愈傷組織的增殖、成熟和萌發四個階段。自Hakman和von Arnold(1985)首次報道由歐洲云杉的未成熟合子胚培養中獲得體細胞胚并再生出植株以來，針葉樹的體細胞胚發生研究已取得了令人矚目的進展。松屬樹種體細胞胚胎發生研究也取得了突破性的進展。1986年，Gupta以5年生糖松成熟胚為外植體建立了細胞懸浮系并分離出胚性愈傷組織，首次經體細胞胚胎發生途徑獲得了完整植株。1987年，Gupta等以火炬松未成熟胚為外植體實現了火炬松的體細胞胚胎發生和植株再生(Gupta et al，1987)。隨后在濕地松、美國五針松、輻射松、洪都拉斯加勒比松、南歐黑松、日本赤松、日本黑松、馬尾松、云南松等多個松種建立了體細胞胚胎發生體系。針對抗病松樹體細胞胚胎發生，亦取得較大進展。2000年，Percy對抗松皰銹病加州山松(Pinus monticola)未成熟胚進行體細胞胚胎發生研究，建立了300個胚性細胞系。孫婷玉等(2015)對抗松材線蟲病黑松未成熟合子胚體細胞胚胎發生進行了相關研究，吳靜等(2015)以抗松材線蟲病赤松未成熟胚為材料誘導并獲得了可穩定增殖的多個胚性細胞系，陳婷婷等(2019)以抗松材線蟲病馬尾松未成熟胚為材料建立了體細胞胚胎發生植株再生體系。

綜上所述，目前國內對松屬樹種的體細胞胚胎發生進行了研究，獲得了大量胚性細胞系。然而，這些細胞系多以合子胚為材料建立的，由于合子胚的雜合性，其誘導產生的愈傷組織分化形成的再生植株的性狀例如抗病性等需經過漫長的田間試驗檢測后才能確定。因此，急需開發一種早期抗性檢測方法以篩選出優良抗性細胞系，從而加速抗病育種進程，為生產上盡快提供大批可廣為應用的抗病良種。Jang等(1990)比較了然而，尚無有關針對松樹愈傷組織抗松材線蟲特性評價的方法。

發明內容