[發明專利]一種并行探測熒光發射差分顯微成像的方法和裝置

在審

• 申請號: 201910292539.1
• 申請日: 2019-04-12
• 公開（公告）號: CN110118726A
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發明（設計）人: 匡翠方;陳宇宸;張乘風;徐良;劉旭;李海峰
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/01
• 分類號: G01N21/01;G01N21/64
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 鄭紅莉

本發明公開了一種并行探測熒光發射差分顯微成像的方法和裝置，具體為：激光器發出激光光束，將其準直后轉換為線偏光；對線偏振光進行相位調制，調制圖案為0相位圖，再將其轉換為圓偏振光后投射在待測樣品上進行二維掃描；使用探測器陣列收集所述待測樣品發出的熒光信號，歸一化處理獲得并行探測熒光信號光強；將調制圖案切換為渦旋相位圖，再次對所述線偏振光進行相位調制，重復上述步驟再次獲得并行探測熒光信號光強；最后，將兩次掃描獲得的并行探測熒光信號光強相減獲得并行探測差分信號光強。本發明的分辨率高、信噪比好，同時能夠十分簡單地由傳統的共聚焦顯微系統改裝而成，并且操作方便，對光功率的需求低。

技術領域

本發明屬于光學超分辨顯微領域，特別涉及一種并行探測熒光發射差分顯微成像的方法和裝置。

背景技術

這幾個世紀以來，光學顯微鏡在科學中發揮了重要作用，為人們觀測微觀結構及其運動提供了一種可行的方法。然而，阿貝衍射極限將常規熒光顯微鏡的分辨能力限制在約為照明光波長的一半，限制了長度尺度小于 100nm的微結構觀察。為此，人們發明了各種超分辨顯微技術，而共焦顯微成像技術是其中應用最為廣泛的一種。共焦成像系統高使用率高主要是由于該技術能夠生成具有高對比度的光學切片圖像，突破了普通光學顯微鏡衍射極限的限制，橫向分辨率是相同數值孔徑的普通光學顯微鏡的1.4 倍，縱向分辨率可以達到亞微米量級，同時具有簡單性，多功能性和無創性的特點，能夠滿足各種樣品和應用需求。

在共焦顯微成像的基礎上，熒光差分顯微成像技術先用一個實心光斑掃描樣品激發熒光，收集熒光信號，再將實心光斑調制為空心光斑用于掃描樣品激發熒光，第二次收集熒光信號，最后將兩個熒光信號做差分處理，得到分辨率更高的樣品圖像。

然而熒光差分顯微成像技術和共焦顯微鏡都是采用針孔來濾除焦平面以外的光信號，從而實現光切片效果，但是過小的針孔會導致收集的焦面信號太弱，從而減小信噪比；較大的針孔會影響其光學切片效果，從而限制了分辨率，因此人們必須通過權衡系統的信噪比和分辨率來確定合適的針孔尺寸。與之前馬也(詳見文獻Ma Y,Kuang C,Fang Y,etal.Virtual fluorescence emission difference microscopy based on photonreassignment[J]. Optics Letters,2015,40(20):4627.)、葛寶梁(詳見文獻Ge B,WangY, Huang Y,et al.Three-dimensional resolution and contrast-enhanced confocalmicroscopy with array detection[J].Optics Letters,2016,41(9):2013.)和李屹成(詳見文獻Li Y,Liu S,Liu D,et al.Image scanning fluorescence emissiondifference microscopy based on a detector array[J].Journal of Microscopy,2017.)提出的幾種基于并行探測和差分顯微技術的方法相比，本發明由于實心斑和空心斑照明成像都采用并行探測技術(馬也采用空心斑照明加并行探測技術，葛寶梁和李屹成采用實心斑照明加并行探測技術)，因此具備更高的分辨率以及信噪比，從而最終能夠獲得質量更高的顯微圖像。

發明內容

本發明的目的為提供一種并行探測熒光發射差分顯微成像的方法，利用該方法可以同時具備小針孔的分辨率優勢與大針孔的收集效率，可以在保持高分辨率的前提下提高圖像的信噪比。