[發明專利]一種快速鑒定食品中豬源成分的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201910290339.2
• 申請日: 2019-04-11
• 公開（公告）號: CN109811070B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 許文濤;羅云波;黃昆侖;張超;杜再慧;馬玉婷
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種快速鑒定食品中豬源成分檢測試劑盒，涉及生物物種鑒定技術領域。本發明首先篩選出一個豬源通用內標準基因Actb，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其位于第8染色體上，在豬物種中拷貝數恒定，不存在等位基因變異，可作為鑒定豬源的靶基因。以該基因為靶序列設計了非對稱擴增引物，非對稱PCR反應產物用于DNA銀納米簇檢測。非對稱PCR反應結合DNA銀納米簇檢測構成快速檢測試劑盒，可快速、靈敏地檢測食品中的豬源成分，檢測靈敏度可達4％(w/w)。本發明非對稱PCR?DNA銀納米簇通用熒光試劑盒使用方法簡單、成本低廉，反應結果易于觀察，特異性好，非常適用于現場實時檢測。

技術領域

本發明涉及生物物種鑒定技術領域，具體的說涉及一種檢測食品中豬源成分的非對稱PCR-DNA銀納米簇快速檢測試劑盒。

背景技術

隨著經濟的高速發展，人民生活水平的提高，我國居民對肉類食品的需求逐年增加。盡管許多國家明確規定要求食品標簽真實明確地標出肉的種類、來源，禁止摻假行為，但是市場上仍有很多肉類摻假的事件發生，例如為了降低成本，驢肉火燒中摻入了豬肉，羊肉中摻入牛肉或豬肉，香腸中摻雜其他肉類等等行為。目前，對于食品摻假的檢測方法主要是PCR加瓊脂糖凝膠電泳的方法，最終結果的判斷需要借助凝膠成像系統等大型儀器來完成，過程比較繁瑣且耗時較長。因此，本發明目的是提供一種食品中豬源成分的快速靈敏檢測試劑盒。

目前，內標準基因已被廣泛地用于鑒別食品摻假，但如何篩選出合適的內標準基因顯得尤為重要。目前國內外的肉制品摻假檢測技術多是針對線粒體上的基因設計特異引物來進行實時熒光定量PCR擴增，由于線粒體基因為多拷貝基因，其檢測靈敏度高，但同時在區分由于銷售、運輸等過程所產生的無意識交叉污染與有意識的非法添加時存在困擾。另外，高拷貝數線粒體DNA的濃度無法和基因組DNA的濃度相對應，因此無法對樣品進行精確定量分析，同時由于線粒體基因同源性極高，難以通過普通PCR實現定性檢測。因此，該方法只能借助熒光定量PCR實現肉類摻假的篩選鑒別。若要鑒別低濃度的無意交叉污染和有意非法添加并明確摻假比例實現快速篩查，則要選擇染色體上的低拷貝基因作為肉類內標準基因。

非對稱PCR是以雙鏈DNA為模板，通過在體系中加入不等量的一對引物，經過循環擴增產生大量單鏈DNA(single-strand DNA，ssDNA)的技術。該技術是獲取單鏈靶標DNA的重要方法。銀納米簇合成模板包括有機模板和無機模板兩類，有機模板主要有DNA和多肽等。以DNA為模板的銀納米簇是通過胞嘧啶與銀離子(Ag+)在高結合力下形成DNA-Ag+復合物，然后利用硼氫化鈉還原銀離子，從而形成的具有高量子產率且激發波長可調的小分子熒光探針。銀納米簇探針與傳統的熒光探針相比較，最大的特點是無需熒光基團標記，而且對DNA成核序列有特異性的結合作用，在分子生物學領域具有巨大應用潛能。

本發明將非對稱PCR與DNA銀納米簇相結合，利用非對稱PCR擴增出篩選出的特異性內標準基因特異序列，然后設計與單鏈靶標特異性互補的DNA銀納米簇探針，獲得在紫外(365nm)條件下可視的熒光產物，以檢測物種成分和鑒定物種來源。本發明操作簡單，無需凝膠電泳等繁瑣的檢測，靈敏度高，完全滿足食品中豬源成分快速檢測的需求。

發明內容

本發明的目的是提供用于檢測食品中豬源成分的豬源通用內標準基因。

本發明另一目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、操作簡單的檢測食品中豬源成分的非對稱PCR-DNA銀納米簇快速檢測試劑盒。

一種用于檢測食品中豬源成分的基因，其為內標基因Actb，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

本發明提供了上述內標準基因Actb在檢測豬源成分中的應用。

本發明提供了上述內標準基因Actb在食品中豬源成分鑒定中的應用。