[發(fā)明專利]基于差異SNP標(biāo)記物的同源基因的融合檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910290300.0
• 申請(qǐng)日: 2019-04-11
• 公開（公告）號(hào): CN110033829B
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李文鋒;潘琪;孫小慶;冷雪;蔣紅果;叢博;李早
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京諾禾心康基因科技有限公司
• 主分類號(hào): G16B30/10
• 分類號(hào): G16B30/10;G16B20/30
• 代理公司: 北京金蓄專利代理有限公司 11544
• 代理人: 洪濤

本發(fā)明涉及基于差異SNP標(biāo)記物的同源基因的融合檢測(cè)方法，本發(fā)明的融合檢測(cè)方法利用兩基因的差異SNP信號(hào)進(jìn)行區(qū)分，繞過測(cè)序深度差異，利用雙端reads的插入片段長(zhǎng)度異常和單端reads的軟截?cái)?soft clip)信號(hào)，進(jìn)行每個(gè)測(cè)序reads序列與同源基因序列進(jìn)行一致性比較，尋找連續(xù)一致性SNP mark，由此推斷得到斷點(diǎn)區(qū)間。本發(fā)明的融合檢測(cè)方法能得到斷點(diǎn)所在區(qū)間，即前半部分最后一個(gè)位點(diǎn)和后半部分第一個(gè)位點(diǎn)，且此區(qū)間的間距依賴于檢測(cè)出來的這兩個(gè)位點(diǎn)的物理距離，以規(guī)避掉常規(guī)結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)方法在重復(fù)序列檢測(cè)中遇到的檢測(cè)不出的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DNA測(cè)序領(lǐng)域，特別是涉及基于差異SNP標(biāo)記物的同源基因的融合檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

DNA(脫氧核糖核酸)測(cè)序，是廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究中的一種重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)學(xué)說發(fā)表之后就開始有相關(guān)的報(bào)道，但是操作流程復(fù)雜而沒有形成規(guī)模。

在1977年，末端終止測(cè)序法在Sanger的研究努力下誕生了。Sanger測(cè)序是先將基因組DNA片斷化，然后克隆到質(zhì)粒載體上，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對(duì)于每個(gè)測(cè)序反應(yīng)，挑出單克隆，并純化質(zhì)粒DNA。每個(gè)循環(huán)測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生以雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)終止，由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。其熒光標(biāo)記的產(chǎn)物梯度，在測(cè)序儀的96或384毛細(xì)管中進(jìn)行高分辨率的電泳分離。當(dāng)不同分子量的熒光標(biāo)記片斷通過檢測(cè)器時(shí)，四通道發(fā)射光譜就構(gòu)成了測(cè)序軌跡。然而Sanger測(cè)序也存在自身的缺點(diǎn)，測(cè)序成本高、通量低、耗時(shí)長(zhǎng)，嚴(yán)重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，二代NGS測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。將片斷化的基因組DNA兩側(cè)連上接頭，隨后運(yùn)用不同的方法來產(chǎn)生幾百萬個(gè)空間固定的PCR克隆陣列(polony)。每個(gè)克隆由單個(gè)文庫片段的多個(gè)拷貝組成，之后進(jìn)行引物雜交和酶延伸反應(yīng)。由于所有的克隆都是系在同一平面上，這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進(jìn)行。同樣地，每個(gè)延伸所摻入的熒光標(biāo)記的成像檢測(cè)也能同時(shí)進(jìn)行，來獲取測(cè)序數(shù)據(jù)。酶拷貝和成像的持續(xù)反復(fù)構(gòu)成了相鄰的測(cè)序閱讀片段。第二代測(cè)序技術(shù)大大降低了測(cè)序成本的同時(shí)，還大幅提高了測(cè)序速度，并且保持了高準(zhǔn)確性，以前完成一個(gè)人類基因組的測(cè)序需要3年時(shí)間，而使用二代測(cè)序技術(shù)則僅僅需要1周，但在序列讀長(zhǎng)方面比起第一代測(cè)序技術(shù)則要短很多。按照測(cè)序范圍來分：主要包括全基因組測(cè)序、全外顯子組測(cè)序和目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序。

目前，利用主流測(cè)序技術(shù)完成模式生物或非模式生物的基因組測(cè)序的過程基本包括以下步驟：

1.文庫制備：將DNA用霧化或超聲波隨機(jī)片段化成幾百堿基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個(gè)核苷酸黏性末端。然后將Illumina測(cè)序接頭與片段連接。

2.錨定橋接：Illumina測(cè)序平臺(tái)在測(cè)序時(shí)，將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面(即Flow cell)。Flow cell被細(xì)分為多個(gè)通道，每個(gè)通道的內(nèi)表面有無數(shù)的被固定的單鏈接頭。將上一個(gè)步驟得到的帶接頭的DNA片段變性成單鏈后與測(cè)序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用。

3.預(yù)擴(kuò)增：?jiǎn)捂湗蛐痛郎y(cè)片段會(huì)被擴(kuò)增成雙鏈橋型片段，在變性過程中釋放出互補(bǔ)的單鏈會(huì)被錨定到附件的固相表面，數(shù)次循環(huán)之后，會(huì)在固相表面形成上百萬條成簇分布的雙鏈待測(cè)片段。

4.測(cè)序：?jiǎn)螇A基延伸測(cè)序在測(cè)序的flow cell中加入四種熒光標(biāo)記的dNTP、DNA聚合酶以及接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，在每一個(gè)測(cè)序簇延伸互補(bǔ)鏈時(shí)，每加入一個(gè)被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相對(duì)應(yīng)的熒光，測(cè)序儀通過捕獲熒光信號(hào)，并通過計(jì)算機(jī)軟件將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為堿基信號(hào)，從而獲得待測(cè)片段的序列信息。

5.數(shù)據(jù)處理。Illumina測(cè)序得到的序列的每一個(gè)堿基都會(huì)有相應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量，測(cè)序質(zhì)量低，說明該堿基測(cè)錯(cuò)的概率就大。因此，通常在做樣本的變異檢測(cè)分析前，通過設(shè)置不同的閾值過濾質(zhì)量較低的序列。