[發(fā)明專利]一種快速鑒定食品中牛源成分的試劑盒及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2019-04-11
• 公開（公告）號: CN109825609B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許文濤;羅云波;黃昆侖;杜再慧;張超
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
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本發(fā)明提供一種快速鑒定食品中牛源成分試劑盒及其應(yīng)用，涉及生物物種鑒定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先篩選出一個牛源通用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因ighmbp2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其位于第29號染色體上，在牛物種中拷貝數(shù)恒定，不存在等位基因變異，可作為鑒定牛源的靶基因。以該基因為靶序列設(shè)計了非對稱擴(kuò)增引物，非對稱PCR反應(yīng)產(chǎn)物用于DNA銀納米簇檢測。非對稱PCR反應(yīng)結(jié)合DNA銀納米簇檢測構(gòu)成快速檢測試劑盒，可快速、靈敏地檢測食品中的牛源成分，檢測靈敏度可達(dá)4％(w/w)。本發(fā)明非對稱PCR?DNA銀納米簇通用熒光試劑盒使用方法簡單、成本低廉，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，非常適用于現(xiàn)場實時檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物物種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體的說涉及一種檢測食品中牛源成分的非對稱PCR-DNA銀納米簇快速檢測試劑盒。

背景技術(shù)

隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人民生活水平的提高，我國居民對肉類食品的需求逐年增加。盡管許多國家明確規(guī)定要求食品標(biāo)簽真實明確地標(biāo)出肉的種類、來源，禁止摻假行為，但是市場上仍有很多肉類摻假的事件發(fā)生，例如為了降低成本，驢肉火燒中摻入了豬肉，牛肉中摻入豬肉，香腸中摻雜其他肉類等等行為。目前，對于食品摻假的檢測方法主要是PCR加瓊脂糖凝膠電泳的方法，最終結(jié)果的判斷需要借助凝膠成像系統(tǒng)等大型儀器來完成，過程比較繁瑣且耗時較長。因此，本發(fā)明目的是提供一種食品中牛源成分的快速靈敏檢測試劑盒。

目前，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因已被廣泛地用于鑒別食品摻假，但如何篩選出合適的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因顯得尤為重要。目前國內(nèi)外的肉制品摻假檢測技術(shù)多是針對線粒體上的基因設(shè)計特異引物來進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增，由于線粒體基因為多拷貝基因，其檢測靈敏度高，但同時在區(qū)分由于銷售、運輸?shù)冗^程所產(chǎn)生的無意識交叉污染與有意識的非法添加時存在困擾。另外，高拷貝數(shù)線粒體DNA的濃度無法和基因組DNA的濃度相對應(yīng)，因此無法對樣品進(jìn)行精確定量分析，同時由于線粒體基因同源性極高，難以通過普通PCR實現(xiàn)定性檢測。因此，該方法只能借助熒光定量PCR實現(xiàn)肉類摻假的篩選鑒別。若要鑒別低濃度的無意交叉污染和有意非法添加并明確摻假比例實現(xiàn)快速篩查，則要選擇染色體上的低拷貝基因作為肉類內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。

非對稱PCR是以雙鏈DNA為模板，通過在體系中加入不等量的一對引物，經(jīng)過循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生大量單鏈DNA(single-strand DNA，ssDNA)的技術(shù)。該技術(shù)是獲取單鏈靶標(biāo)DNA的重要方法。銀納米簇合成模板包括有機(jī)模板和無機(jī)模板兩類，有機(jī)模板主要有DNA和多肽等。以DNA為模板的銀納米簇是通過胞嘧啶與銀離子(Ag+)在高結(jié)合力下形成DNA-Ag+復(fù)合物，然后利用硼氫化鈉還原銀離子，從而形成的具有高量子產(chǎn)率且激發(fā)波長可調(diào)的小分子熒光探針。銀納米簇探針與傳統(tǒng)的熒光探針相比較，最大的特點是無需熒光基團(tuán)標(biāo)記，而且對DNA成核序列有特異性的結(jié)合作用，在分子生物學(xué)領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛能。

本發(fā)明將非對稱PCR與DNA銀納米簇相結(jié)合，利用非對稱PCR擴(kuò)增出篩選出的特異性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因特異序列，然后設(shè)計與單鏈靶標(biāo)特異性互補的DNA銀納米簇探針，獲得在紫外(365nm)條件下可視的熒光產(chǎn)物，以檢測物種成分和鑒定物種來源。本發(fā)明操作簡單，無需凝膠電泳等繁瑣的檢測，靈敏度高，完全滿足食品中牛源成分快速檢測的需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供用于檢測食品中牛源成分的牛源通用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。

本發(fā)明另一目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、操作簡單的檢測食品中牛源成分的非對稱PCR-DNA銀納米簇快速檢測試劑盒。

一種用于檢測食品中牛源成分的基因，其為內(nèi)標(biāo)基因Ighmbp2，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

本發(fā)明提供了上述內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Ighmbp2在檢測牛源成分中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Ighmbp2在食品中牛源成分鑒定中的應(yīng)用。