[發明專利]一種基于原位信號放大的夾心型前列腺特異性抗原光電化學檢測方法

有效

• 申請號: 201910286210.4
• 申請日: 2019-04-10
• 公開（公告）號: CN109932407B
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 張書培;衣歡;高利紅;戴宏;鄭祥欽;宋建榕;韓晴
• 申請（專利權）人: 福建省婦幼保健院
• 主分類號: G01N27/30
• 分類號: G01N27/30;G01N27/327;G01N33/574;G01N33/68
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 王義星

1.一種基于原位信號放大的夾心型前列腺特異性抗原光電化學檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）玻碳電極GCE的預處理：GCE首先在鋪有氧化鋁粉末的麂皮上機械打磨拋光，用二次水洗去表面殘留粉末，再移入超聲水浴中清洗，直至清洗干凈，最后依序用乙醇，稀酸和水徹底洗滌；

（2） Au/Ab₁/PSA修飾電極的制備：滴加3 μL金錐Au NCs溶液于干凈的玻碳電極表面，紅外燈下烘干，冷卻至室溫，然后將3 μL巰基苯硼酸溶液滴涂到修飾過的電極表面，在4 °C下孵育50 min，用二次水清洗，去除多余的溶液，將修飾電極于5 μL濃度為1 mg/mL 的前列腺特異性抗原的抗體Ab₁溶液中4 °C下孵育50 min，隨后使用pH 7.4的磷酸緩沖溶液去除多余的前列腺特異性抗原的抗體Ab₁，再將電極浸入20 μL 濃度為1.0 wt.%的牛血清白蛋白BSA溶液1 h，封閉電極表面上非特異性活性位點，用pH 7.4的磷酸緩沖溶液沖去表面殘余液后，即得到Au/Ab₁修飾電極，將電極浸入5 μL不同濃度的前列腺癌細胞抗原PSA標準溶液中于4°C下孵育50 min，用pH 7.4的磷酸緩沖溶液沖洗電極表面并在室溫條件下自然晾干，得到Au/Ab₁/PSA修飾電極；

（3） Au/Ab₁/PSA/Ab₂/Ag₂S修飾電極的制備：稱取一定量的TiO₂-B固體粉末，用二次水分散均勻，配制成濃度為3 mg/mL的懸浮液，將TiO₂-B溶液與殼聚糖溶液按照體積比為1:2的比例進行混合，搖勻30 min，反應好的溶液在轉速為5000 rpm的轉速下離心10min，去除多余的殼聚糖溶液，再加入一定量的二次水分散，形成TiO₂-B@CS溶液；按照AgNO₃溶液與TiO₂-B@CS體積比為1:1的比例，將一定濃度的AgNO₃溶液加入到TiO₂-B@CS溶液中，搖勻反應30min，使Ag⁺充分吸附到TiO₂-B表面，通過離心，去除多余的Ag⁺，再將固體用二次水分散均勻形成處理過的TiO₂-B溶液；按照體積比為1:3的比例將前列腺特異性抗原二抗Ab₂與處理過的TiO₂-B溶液混合，在4°C下反應2h，離心去除未吸附的二抗，用pH為7.4的磷酸緩沖溶液分散，再加入一定量的BSA溶液封閉非活性位點，得到Ab₂-TiO₂-B@CS-Ag⁺溶液，放置冰箱待用；用移液槍吸取一定量的Ab₂-TiO₂-B@CS-Ag⁺溶液，滴涂到Au/Ab₁/PSA修飾電極上，在4 °C下孵育1 h，用二次水清洗，除去多余的物理吸附，得到Au/Ab₁/PSA/Ab₂電極；在室溫下，將0.26 M的H₂O₂與0.18M的S₂O₃^2-溶液一起滴涂到修飾的Au/Ab₁/PSA/Ab₂電極表面，反應15min，在H₂O₂與TiO₂-B@CS的催化作用下，原位生成Ag₂S，得到Au/Ab₁/PSA/Ab₂/Ag₂S電極；

（4）前列腺特異性抗原的檢測：采用三電極體系進行測定，以Au/Ab₁/PSA/Ab₂/Ag₂S修飾電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為對電極，利用光電化學工作站進行檢測，設置電壓為-0.1 V，每隔10 s進行開關燈，氙燈發射的單色光激發光源使用前由單色儀過濾；在pH 7.4的 PBS緩沖溶液中，通過光電化學工作站進行檢測1×10^-6 ng/mL-50 ng/mL一系列不同濃度的前列腺特異性抗原標準溶液，通過記錄開關燈前后產生的不同電流信號，繪制工作曲線；待測樣品溶液代替前列腺特異性抗原標準溶液進行檢測，檢測的結果可通過工作曲線查得；

所述的TiO₂-B材料由下述方法制備的：TiO₂納米棒的制備用鈦納米線作為前驅體通過溶劑熱法合成， 1 g TiO₂分散到75 mL15 M的KOH水溶液中,搖勻10分鐘后，得到的懸浮液轉移到100 mL的反應釜中，將反應釜放置于170 °C下反應72 h，然后冷卻至室溫，得到的沉積物用醋酸溶液清洗直到pH為7.0，最終產物通過離心收集，在60 °C的鼓風烘箱中干燥12h制得TiO₂納米線，然后取300 mg制得的TiO₂納米線前驅體分散在50mL濃度為8 M的醋酸溶液中，接著將溶液轉移到反應釜中，加熱到180 °C，反應24 h，得到的產物通過離心收集，用二次水和乙醇清洗，在60 °C下干燥一夜即得到TiO₂-B。