[發明專利]用于測定重組人生長激素融合蛋白生物學活性的新方法

在審

• 申請號: 201910282012.0
• 申請日: 2019-04-09
• 公開（公告）號: CN110093451A
• 公開（公告）日: 2019-08-06
• 發明（設計）人: 饒春明;王軍志;姚文榮;范文紅;于雷;秦璽;史新昌;劉蘭
• 申請（專利權）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: C12Q1/6897
• 分類號: C12Q1/6897;C12Q1/02;C12N15/85
• 代理公司: 北京中知法苑知識產權代理事務所(普通合伙) 11226
• 代理人: 常玉明;張蘭海

本發明涉及熒光素酶報告基因法測定重組人生長激素Fc融合蛋白的生物學活性。所述方法利用STAT5反應元件(SGG1)和GHR質粒，轉染HEK293細胞后獲得穩定表達SGG1熒光素酶報告基因和GHR的細胞株，加入生長激素Fc融合蛋白刺激后，激活SGG1反應元件下游熒光素酶報告基因表達，根據熒光信號值擬合四參數曲線確定生長激素Fc融合蛋白的生物學活性。本發明針對生長激素Fc融合蛋白的生物學活性測定建立了易于操作、靈敏度高、變異系數小和準確性高的檢測方法，對于生長激素Fc融合蛋白的研發和生產中的質量控制具有重要的指導作用。

技術領域

本發明涉及治療性重組藥生物學活性檢測領域，建立了快速、簡單和準確的測定重組人生長激素(Growth hormone，GH)融合蛋白生物學活性的方法。

背景技術

GH是一種垂體來源的蛋白質，參與調節生長發育過程中的代謝，其缺乏可以導致兒童生長發育遲緩，成人則為生長激素缺乏綜合征，重組人GH可以糾正上述癥狀。由于GH的半衰期短，需要每日皮下注射，大大增加了治療者的痛苦。為了延長半衰期，長效化重組蛋白藥物成為目前生物技術藥物的研發主流；從技術上講，長效化分主要包括化學修飾(PEG化)和融合蛋白修飾(HSA和抗體Fc片段)兩種策略，其中Fc融合蛋白技術是目前研究最多、進展最快的蛋白融合技術。

盡管新型GH藥物進展迅速，但尚無快速檢測其生物學活性的方法。目前，中國藥典中收錄的GH生物測定的方法是去垂體大鼠體重法和去出題大鼠脛骨法，兩種方法都涉及到大鼠動活體檢測，除了不符合動物保護及動物福利的3R原則，實驗本身操作復雜，變異系數大，亟需體外細胞學方法替代動物體內法。因此，生物技術藥物領域的科研工作者迫切建立建立靈敏、高效、穩定的GH以及類似產品的體外生物學活性檢測方法并探索其可行性，從而滿足此類產品的注冊和評價需求。

本發明采用體外轉基因細胞活性測定方法，利用GH-Fc融合蛋白與GHR結合后，進一步活化細胞內的JAK2-STATs、MAPK和PI3K-GSK3等多條明確的信號通路，從而維持細胞的增殖和分化。

本發明選擇JAK2-STATs信號通路，在HEK293細胞中轉入含有STAT5啟動子的熒光素酶報告基因和GHR受體質粒，獲得HEK293-GHR-Luc細胞株。GH-Fc與受體結合后激活JAK2-STATs信號通路，從而激活STAT5反應元件下游的熒光素酶基因的轉錄，熒光素酶基因表達量的強弱與結合至靶細胞膜上GH受體的GH-Fc含量呈正相關。該方法在操作程序、試驗周期及變異系數方面，明顯優于藥典中去垂體大鼠法。

發明內容

本發明是建立一種快速、簡便的GH-FC融合蛋白生物學活性的測定方法。該方法包括構建表達GHR和STAT5反應元件(本發明中采用SGG1命名，為本科室構建的質粒)的穩定細胞株，GH-Fc融合蛋白刺激后能夠激活STAT5下游熒光素酶報告基因的表達，根據熒光素酶的熒光值擬合四參數曲線，從而確定GH-Fc融合蛋白的生物學活性。

本發明的目的在于提供一種快速測定GH-Fc融合蛋白生物學活性測定方法，所述方法包括：

(1)分別將STAT5反應元件(SGG1)和GHR質粒轉入細胞，加壓篩選單克隆細胞株，獲得穩定表達SGG1和GHR的單克隆細胞株；

(2)將GH-Fc融合蛋白藥物稀釋，加入至(1)細胞中，37℃刺激5h；

(3)棄去上述(2)中的培養液，加入熒光素酶底物測定熒光值，擬合四參數曲線確定GH-Fc融合蛋白的相對生物學活性。

HEK293細胞是人胚胎腎細胞，廣泛應用到藥物的研發、生產和科學研究中。HEK293細胞表面表達GHR受體，與GH結合后可以激活JAK2-STATs、MAPK和PI3K-GSK3等多條明確的信號通路，從而促進細胞的增殖和分化等。