[發(fā)明專利]海鱸虹彩病毒的檢測方法與試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910280122.3
• 申請日: 2019-04-09
• 公開（公告）號: CN110042174A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉振興;覃寶田;馬艷平;郝樂;梁志凌;馬江耀
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 向薇;鄭彤

1.一種海鱸虹彩病毒的CPA檢測試劑盒，其特征在于，包含有檢測引物：LMIV-F3，核苷酸序列為SEQ ID NO.1；LMIV-B3，核苷酸序列為SEQ ID NO.2；LMIV-B2，核苷酸序列為SEQID NO.3；LMIV-B1，核苷酸序列為SEQ ID NO.4；LMIV-CPF，核苷酸序列為SEQ ID NO.5。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CPA檢測試劑盒，其特征在于，所述LMIV-B2的5’端和所述的LMIV-B1的5’端分別標(biāo)記有熒光基團；LMIV-B2的5’端標(biāo)記的熒光基團與LMIV-B1的5’端標(biāo)記的熒光基團不同。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CPA檢測試劑盒，其特征在于，還包括：緩沖液、甜菜堿、Mg²⁺溶液和DNA聚合酶中的至少一種。

4.一種非診斷目的的海鱸虹彩病毒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以待測樣品為模板，以如權(quán)利要求1～3任一項所述的檢測引物，進行CPA擴增：所述CPA擴增體系中，檢測引物的濃度比，以μmol/L計，LMIV-F3：LMIV-B3：LMIV-B2：LMIV-B1：LMIV-CPF為0.4：0.4：(0.6～0.8)：(0.8～1.0)：1；

(2)檢測擴增產(chǎn)物。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以待測樣品為模板，以如權(quán)利要求1～3任一項所述的檢測引物，進行CPA擴增：所述CPA擴增體系中，檢測引物的濃度比，以μmol/L計，LMIV-F3：LMIV-B3：LMIV-B2：LMIV-B1：LMIV-CPF為0.4:0.4：(0.6～0.8)：(0.8～1.0)：1，DNA聚合酶的濃度為0.256U/μL～0.384U/μL，Mg²⁺濃度為4mM/L～8mM/L，甜菜堿濃度為0.4mol/L～0.6mol/L，dNTPs濃度為0.6mM/L～0.7mM/L；擴增條件為57℃～60℃下擴增30～60min；

(2)檢測擴增產(chǎn)物。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測引物的濃度比，以μmol/L計，LMIV-F3：LMIV-B3：LMIV-B2：LMIV-B1：LMIV-CPF為0.4:0.4:0.8:0.8:1。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述DNA聚合酶的濃度為0.256U/μL；和/或

所述Mg²⁺濃度為6mM/L；和/或

所述甜菜堿濃度為0.4mol/L；和/或

所述dNTPs濃度為0.6mM/L。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述CPA擴增的擴增條件為58℃下擴增45min。

9.根據(jù)權(quán)利要求4～8任一項所述的檢測方法，步驟(2)所述的檢測擴增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳法和/或核酸試紙條法。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測擴增產(chǎn)物的結(jié)果判定包括以下至少一種：

(1)取擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳后，置于紫外燈或凝膠成像系統(tǒng)中觀察，觀察到CPA特征性梯狀條帶，則結(jié)果為陽性；無任何條帶，則結(jié)果為陰性；

(2)取擴增產(chǎn)物，用核酸試紙條檢測，觀察到只有一條質(zhì)控線，則結(jié)果為陰性；同時觀察到質(zhì)控線和檢測線，則結(jié)果為陽性；未觀察到質(zhì)控線，則檢測結(jié)果無效。