[發明專利]一種紫花苜蓿的遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201910275841.6
• 申請日: 2019-04-08
• 公開（公告）號: CN109997693B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 冉毅東;高崑;徐虎;張康
• 申請（專利權）人: 北京齊禾生科生物科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 白艷

本發明公開了一種紫花苜蓿的遺傳轉化方法。本發明提供了一種紫花苜蓿遺傳轉化方法，為用紫花苜蓿的莖尖或含有莖尖的組織作為外植體，進行遺傳轉化。與現有技術相比，本發明的優點在于：沒有采用通過誘導葉片愈傷途徑來獲取轉化苗，而是采用誘導莖尖分化途徑來獲取轉化苗，該方法的優勢就是轉化周期短，效率高。本發明建立的苜蓿莖尖快速高效誘導體系能夠極大的縮減轉化周期，并且能夠誘導出大量的叢生芽,為苜蓿的高效擴繁體系及遺傳轉化體系研究提供重要的技術平臺和支持。

技術領域

本發明屬于植物組織培養及遺傳轉化技術領域，具體涉及一種紫花苜蓿的遺傳轉化方法。

背景技術

紫花苜蓿(Medicago sativa)，又名苜蓿，是一種多年生的豆科草本牧草。由于其廣泛分布歐亞大陸及世界各國，同時其莖葉柔嫩鮮美，深受各類家畜喜食，有‘牧草之王’的美譽。常規育種生產的苜蓿已不能滿足社會需求，需要進行轉基因遺傳育種來定向改良苜蓿的品質及抗逆境脅迫的能力。但苜蓿遺傳轉化技術一直屬于植物基因工程領域的難點，受到多方面因素的限制。常見的苜蓿遺傳轉化方法是通過誘導愈傷，通過間接器官分化途徑來獲得轉基因株系，但該方法耗費周期長，愈傷不易分化，再生頻率低等因素的困擾。如何在提高苜蓿叢生芽的誘發速度的同時提高轉化陽性率是技術瓶頸。因此，急需一種直接器官分化途徑的方法在短期內高效獲取大量優良的紫花苜蓿再生分化苗。

發明內容

為解決現有技術中紫花轉化周期長、分化率低的問題，填補了技術空白，本發明提供了如下技術方案：

本發明提供了一種紫花苜蓿遺傳轉化方法，為直接用紫花苜蓿的莖尖或含有莖尖的組織作為外植體(無需誘導愈傷組織)，進行遺傳轉化。

上述方法中，所述方法包括如下步驟：

1)將外源DNA分子轉染所述紫花苜蓿的莖尖或含有莖尖的組織，培養，得到侵染后外植體；

具體侵染為將所述紫花苜蓿的莖尖或含有莖尖的組織在含有外源DNA分子的農桿菌中侵染1h；

2)將所述侵染后外植體在含有篩選劑的叢生芽誘導培養基中誘導培養，得到具有叢生芽外植體；

3)將所述具有叢生芽外植體在抗性芽伸長培養基中伸長培養，得到具有抗性芽外植體；

4)將所述具有抗性芽外植體在生根培養基中生根培養，得到再生紫花苜蓿植株，實現紫花苜蓿遺傳轉化。

上述方法中，所述含有篩選劑的叢生芽誘導培養基包括用于組培的基本培養基、20-30g/L蔗糖、1.4-1.6mg/L 6-芐氨基嘌呤、0.35-0.45mg/L篩選劑和200-300mg/L抑菌劑。

上述方法中，所述抗性芽伸長培養基包括用于組培的基本培養基、20-30g/L蔗糖、0.05-0.15mg/L吲哚乙酸、0.4-0.6mg/L赤霉素、0.3-0.5mg/L篩選劑、200-300mg/L抑菌劑；

或，所述生根培養基包括用于組培的基本培養基、10-20g/L蔗糖、0.4-0.6mg/L吲哚乙酸、0.3-0.5mg/L篩選劑、100-200mg/L抑菌劑。

上述方法中，所述各個培養基均還包括凝固劑；

或，所述用于組培的基本培養基為用于組培的液體基本培養基；

或，所述含有篩選劑的叢生芽誘導培養基由用于組培的基本培養基、20-30g/L蔗糖、1.4-1.6mg/L 6-芐氨基嘌呤、0.35-0.45mg/L篩選劑、200-300mg/L抑菌劑和6-7g/L凝固劑組成；

或，所述抗性芽伸長培養基由用于組培的基本培養基、20-30g/L蔗糖、0.05-0.15mg/L吲哚乙酸、0.4-0.6mg/L赤霉素、0.3-0.5mg/L篩選劑、200-300mg/L抑菌劑和6-7g/L凝固劑組成；