[發(fā)明專利]鯉浮腫病毒和錦鯉皰疹病毒雙重實時熒光定量檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910275066.4
• 申請日: 2019-04-08
• 公開（公告）號: CN109897918B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張文;徐立蒲;呂曉楠
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 天津合正知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12229
• 代理人: 呂琦

1.一種鯉浮腫病毒和錦鯉皰疹病毒雙重實時熒光定量PCR檢測方法，所述檢測方法為非疾病診斷方法，其特征在于，包括以下步驟：

第一、合成引物與TaqMan探針：

根據(jù)CEV P4a基因序列，對現(xiàn)有引物序列進(jìn)行優(yōu)化，上游引物第1個堿基改為簡并堿基W，下游引物第1個堿基改為簡并堿基R，合成1對特異性引物和1條TaqMan探針；根據(jù)KHVORF7基因保守序列，設(shè)計1對特異性引物和1條TaqMan探針；分別使用FAM和VIC作為探針報告基團，BHQ1作為探針淬滅基團；

所述CEV P4a基因序列對引物序列進(jìn)行優(yōu)化的下游引物為CEV-R，所述優(yōu)化后的CEV-R序列為 RATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA；

所述CEV P4a基因序列對引物序列進(jìn)行優(yōu)化的上游引物為CEV-F，所述優(yōu)化后的CEV-F序列為WGTTTTGTAKATTGTAGCATTTCC；

所述CEV P4a基因序列探針為CEV-Probe，所述CEV-Probe序列為FAM-AGAGTTTGTTTCTTGCCATACAAACT-BHQ1；

所述KHV ORF7基因保守序列設(shè)計的下游引物為KHV-R，所述KHV-R序列為CACGGATCTTCTATGCTACA；

所述KHV ORF7基因保守序列設(shè)計的上游引物為KHV-F，所述KHV-F序列為TTGTTGTGCGTTGATGTTC；

所述KHV-Probe序列為VIC-CTTGACGGCACTCGTCGAGCCGTAGCCC-BHQ1；

第二、確定反應(yīng)體系及條件：

采用20 μL反應(yīng)體系，2×Probe PCR Master Mix 10μL，上、下游引物和探針終濃度在0.2μmol/L～0.8μmol/L之間，QN ROX 參考染料0.1μL，模板2.5μL，DEPC水補足20μL；反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性2 min，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，50～60 ℃退火31 s，40個循環(huán)。

2.如權(quán)利要求1所述的鯉浮腫病毒和錦鯉皰疹病毒雙重實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，反應(yīng)體系確定為：2×Probe PCR Master Mix 10μL，CEV上、下游引物終濃度0.6μmol/L，探針終濃度0.3μmol/L，KHV上、下游引物終濃度0.4 μmol/L，探針終濃度0.2μmol/L，QN ROX 參考染料0.1 μL；模板2.5 μL，DEPC水補足20 μL；反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性2min，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，56 ℃退火31 s，40個循環(huán)。

3.如權(quán)利要求1所述的鯉浮腫病毒和錦鯉皰疹病毒雙重實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所述的鯉浮腫病毒和錦鯉皰疹病毒雙重實時熒光定量PCR檢測方法對CEV和KHV的靈敏度為15 copies/μL。

4.如權(quán)利要求1所述的鯉浮腫病毒和錦鯉皰疹病毒雙重實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所述的鯉浮腫病毒和錦鯉皰疹病毒雙重實時熒光定量PCR檢測方法與單重實時熒光定量PCR擴增所獲得的Ct值的變異系數(shù)小于3%。