[發(fā)明專利]一種制備肌氨酸氧化酶的基因工程菌及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請日: 2019-04-04
• 公開（公告）號(hào): CN109957538A
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 遲乃玉;劉洋;張慶芳;于爽;希倫
• 申請（專利權(quán)）人: 大連大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N9/06;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 大連八方知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21226
• 代理人: 朱秀芬

本發(fā)明屬于基因工程和蛋白表達(dá)工程領(lǐng)域，涉及一種生物工程技術(shù)高效制備肌氨酸氧化酶的方法，以CGMCC No.17306為出發(fā)菌株，經(jīng)比對獲得菌株CGMCC No.17306的肌氨酸氧化酶基因，通過基因合成獲得目的基因，并構(gòu)建表達(dá)載體SOX?pET，將表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建獲得所述的產(chǎn)肌氨酸氧化酶的基因工程菌GLYH18。本發(fā)明還提供了所述產(chǎn)肌氨酸氧化酶的基因工程菌用于發(fā)酵生產(chǎn)肌氨酸氧化酶的應(yīng)用。本發(fā)明操作簡單，成本低，成品率高，且篩選出的肌氨酸氧化酶酶活高、熱穩(wěn)定性好，比起野生菌株，重組的基因工程菌更具備工業(yè)化生產(chǎn)能力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和蛋白表達(dá)工程領(lǐng)域，涉及一種生物工程技術(shù)高效制備肌氨酸氧化酶的方法，產(chǎn)物可用于生產(chǎn)肌氨酸檢測試劑盒。

背景技術(shù)

肌氨酸又名N-甲基甘氨酸，是膽堿自然代謝為甘氨酸過程中的一個(gè)非編碼氨基酸中間體，可以由氯乙酸與甲胺反應(yīng)制得，也可以由甘氨酸通過N-甲基轉(zhuǎn)移酶作用生成。肌氨酸有甜味，溶于水，存在于人體的肌肉及其他一些組織中，生理狀態(tài)下正常人體血清中的肌氨酸含量是(1.59±1.08)nmol/L。

2009年，Sreekumar等發(fā)現(xiàn)肌氨酸可激活前列腺癌細(xì)胞，并且其在尿液中被檢測到意味著惡性前列腺癌的發(fā)生。肌氨酸成為前列腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移時(shí)顯著增加的一個(gè)代謝產(chǎn)物，能夠在尿液中被檢測到，因而被確定為前列腺癌的一個(gè)特異性指標(biāo)。

目前用于檢測肌氨酸的方法主要有液相色譜或氣象色譜與質(zhì)譜聯(lián)用檢測法、肌氨酸氧化酶熒光檢測法、毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測法、肌氨酸氧化酶分光光度檢測法。而肌氨酸氧化酶分光光度法，檢測成本低，可適用于目前任何一種全自動(dòng)生化分析儀，可滿足于臨床大批量樣品的檢測需要。

肌氨酸氧化酶作為一種重要的診斷酶制劑，盡管目前許多國內(nèi)外學(xué)者對其已有研究，但在實(shí)際生產(chǎn)中仍然存在產(chǎn)量低、熱穩(wěn)定性不好的問題，且國內(nèi)研究較少，因此如何快速制備出酶活高、產(chǎn)量高適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的肌氨酸氧化酶具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種產(chǎn)肌氨酸氧化酶的基因工程菌。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于，提供一種肌氨酸氧化酶的生產(chǎn)方法，通過發(fā)酵生產(chǎn)上述所述的產(chǎn)肌氨酸氧化酶的基因工程菌獲得肌氨酸氧化酶。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種產(chǎn)肌氨酸氧化酶的基因工程菌用于發(fā)酵生產(chǎn)肌氨酸氧化酶的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種產(chǎn)肌氨酸氧化酶的基因工程菌，是將保藏號(hào)CGMCC No.17306的LYH18菌株的肌氨酸氧化酶基因進(jìn)行克隆后，導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)構(gòu)建獲得。

一種產(chǎn)肌氨酸氧化酶的基因工程菌的構(gòu)建方法；以CGMCC No.17306為出發(fā)菌株，經(jīng)比對獲得菌株CGMCC No.17306的肌氨酸氧化酶基因，通過基因合成獲得基因，并構(gòu)建表達(dá)載體SOX-pET，將表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建獲得所述的產(chǎn)肌氨酸氧化酶的基因工程菌。

進(jìn)一步的，所述的構(gòu)建方法包括如下步驟：

(1)獲得目的序列：以芽孢桿菌CGMCC No.17306為出發(fā)菌株，與現(xiàn)有肌氨酸氧化酶基因比對得到原始肌氨酸氧化酶基因，改造并全基因合成微生物來源肌氨酸氧化酶編碼基因序列，如SEQ No.1所示；

(2)克隆載體構(gòu)建：將步驟(1)中經(jīng)過改造后肌氨酸氧化酶基編碼基因序列插入表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建成表達(dá)載體，命名為載體SOX-pET。

(3)目的基因擴(kuò)增：以SOX-pET為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物鑒定純度和分子量的大小，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒回收。