[發明專利]改造宿主細胞基因組的方法及其用途

有效

• 申請號: 201910264952.7
• 申請日: 2019-04-03
• 公開（公告）號: CN110564772B
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 高聞達;毛昌群;邵靜;岳國華
• 申請（專利權）人: 安泰吉（北京）生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

1.一種在宿主細胞的指定位點整合多種外源基因的方法，所述方法包括以下步驟：

1)制備“錨定”的宿主細胞，所述“錨定”的宿主細胞包含位點特異性重組酶識別序列LoxPwt、LoxP1和PGK啟動子驅動的正篩選序列；

2)制備含有外源基因的定點整合載體系列，其中包括：

第一定點整合載體，其使用第一載體制備，包含第一外源基因，第一抗生素抗性基因、位點特異性重組酶識別序列LoxPwt、LoxP4和LoxP2；

第二定點整合載體，其使用第二載體制備，包含第二外源基因，第二抗生素抗性基因、位點特異性重組酶識別序列LoxPwt、LoxP1和LoxP5；

3)使用第一定點整合載體轉染宿主細胞，并用第一抗生素篩選出第一抗生素抗性、第二抗生素敏感的克隆；

4)使用第二定點整合載體轉染步驟3)得到的克隆，并用第二抗生素篩選出第二抗生素抗性、第一抗生素敏感的克隆；

其中，所述指定位點選自GAPDH基因的區域。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟1)中，所述正篩選序列為Puro-T2A-d1EGFP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

3.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟1)中，所述“錨定”的宿主細胞通過打靶載體獲得，所述打靶載體含有指定位點的同源左右臂、位點特異性重組酶識別序列LoxPwt、LoxP1和正負篩選序列。

4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述打靶載體依次含有GAPDH同源左臂、Zeocin-T2A-TK的負篩選序列、Puro-T2A-d1EGFP的正篩選序列，Cre-LoxP系統中的位點特異性重組酶識別序列LoxPwt和LoxP1、GAPDH同源右臂和白喉霉素A鏈(DTA)的負篩選序列。

5.根據權利要求4所述的方法，其中，所述打靶載體的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。

6.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟2)中，所述含有外源基因的定點整合載體系列還包括：

第三定點整合載體，其使用第一載體制備，包含第三外源基因，第一抗生素抗性基因、位點特異性重組酶識別序列LoxPwt、LoxP4和LoxP2。

7.根據權利要求6所述的方法，其中，在步驟2)中，所述含有外源基因的定點整合載體系列還包括：

第四定點整合載體，其使用第二載體制備，包含第四外源基因，第二抗生素抗性基因、位點特異性重組酶識別序列LoxPwt、LoxP1和LoxP5。

8.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟2)中，根據擬整合的基因制備相應的載體。

9.根據權利要求6所述的方法，其中，所述方法還包括步驟5)：使用第三定點整合載體轉染步驟4)得到的克隆，并用第一抗生素篩選出第一抗生素抗性、第二抗生素敏感的克隆。

10.根據權利要求7所述的方法，其中，所述方法還包括步驟6)：使用第四定點整合載體轉染步驟5)得到的克隆，并用第二抗生素篩選出第二抗生素抗性、第一抗生素敏感的克隆。

11.根據權利要求8所述的方法，其中，所述方法還包括步驟7)：根據擬整合的基因制備相應的載體依次整合，得到在指定位點整合多種基因的宿主細胞。

12.根據權利要求1、6或7所述的方法，其中，在步驟3)和4)中，所述第一抗生素抗性基因和第二抗生素抗性基因分別選自以下的兩個：

潮霉素B基因、嘌呤霉素抗性基因、遺傳霉素基因、殺稻瘟菌素基因、腐草霉素基因。

13.根據權利要求1、6或7所述的方法，其中，在步驟3)和4)中，所述第一抗生素抗性基因和/或第二抗生素基因還通過自動切割肽段連接示蹤蛋白的基因序列。