[發明專利]神經細胞稀疏高亮度標記重組腺相關病毒的包裝方法及其應用

有效

• 申請號: 201910259250.X
• 申請日: 2019-03-29
• 公開（公告）號: CN109880807B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 靳森;孫佩;徐富強;張玉慧;陶斯玨
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢物理與數學研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;A01K67/027
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 江麗麗;王敏鋒

本發明公開了一種用于神經細胞稀疏高亮度標記的重組腺相關病毒的包裝方法及其應用，通過將剪切酶的核心表達質粒和對應的剪切酶依賴的熒光蛋白質粒混合成表達質粒混合物，然后與重組腺相關病毒輔助包裝質粒共同轉染包裝細胞后，經過純化獲得穩定性良好的單一重組腺相關病毒集合。相比于不同表達質粒分別單獨包裝成重組腺相關病毒后混合感染的方法，通過本發明可以明顯降低不同重組腺相關病毒混合共感染所造成的排斥問題，獲得的新型重組腺相關病毒可用于神經細胞數目稀少且高亮度的標記，結合一定的成像手段，可以獲得神經細胞局部的高清形態，還可以獲得單個神經細胞在全腦尺度的完整細胞形態，即單個神經細胞在全腦完整的樹突纖維投射。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于神經細胞稀疏高亮度標記的重組腺相關病毒的包裝方法及其應用，該重組腺相關病毒主要用于解析神經細胞切片水平局部形態以及全腦水平單個神經細胞的完整軸樹突投射形態等。

背景技術

神經環路是大腦行使各項功能的結構基礎，是由數量龐大、種類多樣的神經元之間通過突觸連接形成，其結構的精確解析有助于人們更好地理解大腦的工作原理。目前介觀水平常用的研究神經環路結構的方法主要分為群體標記和稀疏標記。其中群體標記是指標記大腦特定腦區群體神經元，以研究群體神經元的神經網絡結構。然而由于群體神經元中每個個體形態結構千差萬別，不同個體之間軸樹突纖維彼此相互纏繞，群體標記很難揭示每個個體神經元的清晰完整的結構特征，制約了對神經環路精細組織構架的理解。因此人們開發各種稀疏標記方法，以期對神經細胞進行少量高亮度標記，結合一定的成像手段，研究單個神經細胞的全腦完整形態，進而理解單個神經細胞的信息輸入和輸出的走向，更進一步理解不同單個神經細胞之間如何組織形成神經環路。

目前常用的稀疏標記方法主要包括轉基因小鼠遺傳學標記以及病毒標記等，其中病毒標記以重組腺相關病毒(rAAV)的應用最為廣泛。rAAV是一種單鏈DNA 病毒，具有免疫原性低，可導入外源基因，能在動物體內長期穩定表達等特點，已廣泛應用于大腦神經科學等多個領域的研究[1]。現有稀疏標記方法能在一定程度上滿足對小鼠大腦神經細胞少量亮度較高的標記。具體的稀疏標記方法主要有：

1、通過Cre-ER轉基因小鼠控制他莫昔芬劑量藥物誘導[2-4]；

2、將高倍稀釋的表達Cre剪切酶的rAAV病毒與Cre剪切酶依賴的表達熒光蛋白的rAAV病毒混合后注射小鼠大腦特定腦區[5]；

3、逆向標記病毒啟動上游表達[6,7]；

4、利用四環素誘導表達系統中的泄露機制進行稀疏標記[7,8]。

上述方法依然存在不少問題，比如方法1中轉基因小鼠藥物誘導表達方法中單個神經細胞的熒光亮度相比于病毒標記神經細胞的熒光亮度仍有一定的差距，且由于不同轉基因小鼠特定細胞類型神經細胞中Cre-ER表達水平差異性較大等因素，被標記的神經細胞的數量和密度均不可控。上述方法2和方法4混合兩種不同的rAAV病毒注射大腦會導致每個病毒組分相互排斥，這是由病毒本身的感染特性所決定的，不同種病毒或者同種病毒攜帶不同元件混合共感染細胞會導致相互排斥[9-11]，進而導致被感染神經細胞長程軸突投射末梢的熒光亮度不高，無法完整高效地標記出神經細胞在全腦水平的完整軸突投射形態。同時方法2 無法實現對特定細胞類型神經細胞的標記，限制了該方法在單個特定細胞類型神經細胞完整形態研究中的應用。方法4中病毒泄露表達有一定的隨機性，因此被標記神經元的數量和密度均不可控，且不同批次病毒混合標記結果差別較大。方法3中病毒逆向啟動標記無法同時兼顧投射特異性和細胞類型特異性標記，且由于逆向啟動標記的犬腺病毒CAV和RetroAAV病毒或者其它病毒均存在感染神經元細胞類型偏好性或者毒性等問題[12]，因此被標記的神經細胞類型、熒光亮度以及完整細胞形態都會受到一定影響。