[發明專利]分泌抗狂犬病毒M蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株及應用

有效

• 申請號: 201910258004.2
• 申請日: 2019-04-01
• 公開（公告）號: CN109970852B
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 周繼勇
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N5/20;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 韓聰

本發明公開了一種分泌抗狂犬病毒M蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株及應用，屬于生物技術領域。所述雜交瘤細胞株的分類命名為雜交瘤細胞株4A1，于2019年4月1日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO：C201947。該雜交瘤細胞株制備的單克隆抗體效價高，特異性好，生物學特性優良；鑒定了其識別RABV M蛋白的精細抗原變異表位，能夠用于區分疫苗Flury毒株和其它RABV毒株；將其應用于制備檢測狂犬病毒RABV的試劑盒，可以檢測RABV感染以及鑒別診斷疫苗Flury毒株和其它RABV毒株。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種分泌抗狂犬病毒M蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株及應用。

背景技術

狂犬病(Rabies)是由狂犬病毒(RABV)引起的一種高度致死性人畜共患傳染病。RABV感染發病后，致死率幾乎為100％，是迄今為止人類歷史上死亡率最高的急性傳染病。目前仍無任何治療措施，只能通過疫苗免疫接種預防RABV感染。在全球范圍內有150多個國家均有狂犬病病例報道，每年約有5～7萬人死于狂犬病，其中95％的病例發生在非洲和亞洲。中國的人狂犬病感染病例僅次于印度，位于亞洲第二位。犬是RABV最常見的病毒儲藏庫，99％的人感染狂犬病是由犬傳播介導的。

RABV在病毒分類學上屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)的成員，是單股副鏈非節段RNA病毒，其基因組主要編碼核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依賴的RNA聚合酶蛋白(L)。M蛋白，由202個氨基酸組成，約23kDa，是RABV病毒粒子最小、含量最豐富的一種非糖基化蛋白，其位于病毒囊膜和核衣殼之間，起到連接G蛋白和核衣殼的作用。M蛋白具有多種功能：參與病毒粒子的組裝和出芽，對病毒粒子形態呈長桿狀起到決定因素，調控病毒的轉錄和翻譯過程，參與決定病毒的致病力，誘導細胞凋亡，抑制宿主相關基因的表達等。

目前已制備出的抗RABV蛋白的單克隆抗體主要是NP蛋白和G蛋白。NP蛋白單克隆抗體可用來區分狂犬病毒屬不同血清型；G蛋白單克隆抗體則表現出較高的中和活性。RABVM蛋白的單克隆抗體報道很少，而且M蛋白單克隆抗體識別的精細表位還不清楚，缺乏對這些單克隆抗體生物學特性的了解，因此也限制了抗M蛋白單克隆抗體在病毒診斷中的應用，以及對M蛋白結構和抗原特性的研究。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能分泌特異性識別RABV M蛋白的單克隆單體的雜交瘤細胞株，其分泌的單克隆抗體能與RABV毒株發生特異性反應，不能與疫苗Flury毒株發生反應。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種分泌抗狂犬病毒M蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株的分類命名為雜交瘤細胞株4A1，于2019年4月1日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢、武漢大學，保藏編號為CCTCC NO：C201947。

本發明首先從建立的雜交瘤細胞庫中得到12株穩定分泌抗狂犬病毒RABV M蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，并最終篩選出雜交瘤細胞4A1株，其生物學特性優良。采用間接酶聯免疫吸附分析法測得制備的小鼠腹水單克隆抗體4A1的效價為1×10⁵。

本發明還提供了由雜交瘤細胞4A1株制備得到的抗狂犬病毒M蛋白的單克隆抗體。

本發明首次鑒定了該單克隆抗體所識別的變異抗原表位，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。該抗原表位在不同的RABV毒株M蛋白上相對保守，但在疫苗Flury毒株上存在抗原變異(Flury毒株氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)，導致單克隆抗體不能識別。因此，本發明提供的單克隆抗體能與狂犬病毒毒株發生特異性反應，但是不能與疫苗Flury毒株反應。